Биолюминесцентный резонансный перенос энергии (BRET) для измерения взаимодействий CRAF с белками 14-3-3 в живых клетках
Summary
Этот протокол описывает анализ на основе БРЭТ для измерения взаимодействий киназы CRAF с белками 14-3-3 в живых клетках. В протоколе изложены шаги по подготовке ячеек, считыванию излучений BRET и анализу данных. Также представлен пример результата с идентификацией соответствующих элементов управления и устранением неполадок для оптимизации анализа.
Abstract
CRAF является первичным эффектором ГТФаз RAS и играет решающую роль в онкогенезе нескольких видов рака, вызванных KRAS. Кроме того, CRAF является горячей точкой для мутаций зародышевой линии, которые, как показано, вызывают развитие RASopathy, синдром Нунан. Все RAF-киназы содержат множественные фосфорилирование-зависимые сайты связывания для 14-3-3 регуляторных белков. Дифференциальное связывание 14-3-3 с этими сайтами играет важную роль в образовании активных димеров RAF на плазматической мембране в условиях передачи сигналов и в поддержании аутоингибирования RAF в условиях покоя. Понимание того, как регулируются эти взаимодействия и как они могут быть модулированы, имеет решающее значение для определения новых терапевтических подходов, нацеленных на функцию RAF. В этой статье я опишу анализ на основе биолюминесцентного резонансного переноса энергии (BRET) для измерения взаимодействий CRAF с белками 14-3-3 в живых клетках. В частности, этот анализ измеряет взаимодействия CRAF, слитых с донором нанолюциферазы, и 14-3-3, слитых с акцептором метки Halo, где взаимодействие RAF и 14-3-3 приводит к передаче энергии от донора к акцептору и генерации сигнала BRET. Протокол также показывает, что этот сигнал может быть нарушен мутациями, которые, как было показано, предотвращают связывание 14-3-3 с каждым из его высокоаффинных стыковочных сайтов RAF. В этом протоколе описаны процедуры посева, трансфекции и повторного посева клеток, а также подробные инструкции по считыванию эмиссии BRET, выполнению анализа данных и подтверждению уровней экспрессии белка. Кроме того, приводятся примеры результатов анализа, а также шаги по оптимизации и устранению неполадок.
Introduction
RAF-киназы (ARAF, BRAF и CRAF) являются прямыми эффекторами ГТФаз RAS и инициирующими членами каскада киназ RAF-MEK-ERK, способствующего пролиферации/выживанию. Недавние исследования показали, что экспрессия CRAF играет ключевую роль в онкогенезе нескольких видов рака, вызванных KRAS, включая немелкоклеточный рак легкого и протоковую аденокарциному поджелудочной железы 1,2,3,4,5. Кроме того, мутации зародышевой линии CRAF вызывают особенно тяжелую форму РАСопатии – синдромНунан 6,7. Понимание регуляции CRAF имеет решающее значение для разработки успешных терапевтических подходов, направленных на его функцию в клетках.
Все RAF-киназы можно разделить на два функциональных домена: С-концевой каталитический (CAT) домен и N-концевой регуляторный домен (REG), который контролирует его активность (рис. 1A). Домен REG включает в себя RAS связывающий домен (RBD), цистеин-богатый домен (CRD) и серин/треонин-богатую область (S/T-rich). Примечательно, что S/T-богатая область содержит N’-сайт, который связывается с 14-3-3 фосфорилированием-зависимым образом (S259 в CRAF; Рисунок 1А) 8. Домен CAT включает в себя домен киназы вместе со вторым высокоаффинным сайтом стыковки 14-3-3, называемым сайтом C’ (S621 в CRAF; Рисунок 1А) 8. Дифференциальное связывание димерных белков 14-3-3 с сайтами N’ и C’, наряду с CRD, играет решающую роль как в активации, так и в ингибировании RAF 9,10,11,12,13. В нормальных сигнальных условиях активация RAF инициируется его привлечением к плазматической мембране RAS, что позволяет ему образовывать активные димеры, из которых гетеродимер BRAF-CRAF является преобладающей активной формой 14,15. Биохимические анализы с использованием BRAF и CRAF, наряду с криогенной электронной микроскопией (Cryo-EM) структур димерных BRAF, показывают, что димер 14-3-3 стабилизирует активные димеры RAF, связываясь одновременно с C’-сайтом обоих протомеров RAF (рис. 1B)9,13,16,17. И наоборот, исследования показали, что в условиях покоя RAF принимает цитозольное, аутоингибированное подтверждение, когда домен REG связывается с доменом CAT и ингибирует его активность 12,18,19,20. Это закрытое состояние стабилизируется димером 14-3-3, связанным с CRD и N’ сайтом в домене REG и с сайтом C’ в домене CAT (рис. 1B)10,13,21. В BRAF эта модель подтверждается недавними крио-ЭМ структурами аутоингибированных мономеров BRAF и нашими предыдущими биохимическими исследованиями 10,12,13,21,22. Однако, в то время как показано, что 14-3-3 играет ингибирующую роль в регуляции23 CRAF, аутоингибированное состояние, подобное BRAF, может играть меньшую роль в регуляции12 CRAF; поэтому необходимы дальнейшие исследования для уточнения механизмов, с помощью которых белки 14-3-3 регулируют активность CRAF. 14-3-3-опосредованная регуляция RAF-киназ требует множества событий фосфорилирования и дефосфорилирования RAF, связывания с различными регуляторными белками и взаимодействия с плазматической мембраной. Поэтому крайне важно, чтобы взаимодействия 14-3-3-RAF измерялись в физиологически значимых условиях и в присутствии интактного липидного бислоя.
Для решения этой проблемы была использована технология NanoBRET (далее именуемая N-BRET; подробную информацию о наборе см. в Таблице материалов) для разработки анализа на основе близости для измерения взаимодействий CRAF с белками 14-3-3 в живых клетках (рис. 1C). Эта система на основе БРЭТ измеряет взаимодействия двух представляющих интерес белков (POI), где один белок помечен донором нанолюциферазы (Nano), а другой — меткой Halo, для мечения лигандом22,24 акцептора энергии Halo618. Взаимодействие представляющих интерес белков приводит к передаче энергии от донора к акцептору, который, в свою очередь, генерирует сигнал BRET (рис. 1C). Чрезвычайно яркий донорский белок Nano (излучение (em) 460 нм) и лиганд Halo618 (em 618 нм) обеспечивают большее спектральное разделение и чувствительность по сравнению с обычным BRET, что делает его идеальной платформой для изучения более слабых взаимодействий и обнаружения тонких изменений в связывании24. Действительно, ранее мы разработали анализ на основе N-BRET для измерения аутоингибиторных взаимодействий доменов RAF REG и CAT, что было важно для характеристики панели мутаций RASopathy в BRAF CRD и продемонстрировало критическую важность этого домена для поддержания аутоингибирования и предотвращения конститутивной активации BRAF12.
Описанный здесь анализ измеряет взаимодействия CRAF, слитого с N-концевой Nano-меткой (Nano-CRAF), и дзета-изоформы 14-3-3, слитой с C-концевой Halo меткой (14-3-3ζ-Halo; Рисунок 1С). Мы показываем, что взаимодействие Nano-CRAF с 14-3-3ζ-Halo генерирует устойчивый сигнал BRET, который, в свою очередь, может быть нарушен мутациями, препятствующими связыванию 14-3-3 с сайтом N’ (S259A) и/или сайтом C’ (S621A). В следующем протоколе подробно описаны инструкции по выполнению, оптимизации и устранению неполадок этого анализа.
Protocol
Representative Results
Discussion
Предыдущие исследования показали, что белки 14-3-3 играют решающую роль как в активации, так и в ингибировании киназ RAF. Понимание того, как регулируются эти события связывания и влияние модуляции этих взаимодействий на передачу сигналов RAF и онкогенез, вызванный RAF, может выявить новые тер…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот проект был частично профинансирован за счет федеральных средств Национального института рака, Национальных институтов здравоохранения, под номером ZIA BC 010329.
Materials
| Antibodies | |||
| HaloTag® mouse monoclonal antibody | Promega | G9211 | Antibody for detecting HaloTag tagged proteins by immunoblot |
| NanoLuc® mouse monoclonal antibody | R&D Systems | MAB10026 | Antibody for detecting Nano-tagged proteins by immunoblot |
| CRAF mouse monoclonal antibody (E10) | Santa Crus Biotechnology | sc-7267 | Antibody directly detecting CRAF proteins by immunoblot |
| ECL anti-mouse HRP secondary antibody | Amersham | NA931-1ML | Secondary HRP conjugated mouse antibody (from sheep) |
| Reagents | |||
| X-tremeGENE™ 9 | Roche/Sigma | 6365809001 | |
| NanoBRET™ kit | Promega | N1661 | NanoBRET kit containing Halo 618 ligand and NanoGlo (nanoluciferase) substrate |
| DPBS, without Ca++ and Mg++ | Quality Biologicals | 114-057-101 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Life Technologies | 25300120 | |
| DMEM cell culture media | Life Technologies | 11995073 | High glucose, L-glutamine, phenol red, sodium pyruvate; without HEPES, suppliment media with 10% FBS, 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin |
| L-Glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030164 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140163 | |
| Opti-MEM™ I reduced serum media | Gibco | 31985062 | For cell transfection |
| Opti-MEM reduced serum media, no phenol red | Gibco | 11058021 | For replating cells on Day 3. Supplement with 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin, along with 10% FBS (where indicated). |
| Invitrogen Trypan Blue Stain | Thermo Scientific | T10282 | |
| NP40 lysis buffer | N/A | N/A | 20 mM Tris (pH 8.0), 137mM NaCl, 10% glycerol, NP40 alternative (Milipore, Cat# 492016). Store at 4 degrees C.. Add the following protease and phosphatase immediately prior to use: 20 µM leupeptin, 0.5 mM sodium orthovanidate, 0.15 U/mL, 1mM PMSF. |
| 5x gel sample buffer | N/A | N/A | 240 mM Tris (pH 8.0), 9.5% SDS, 30% glycerol, 500mM DTT, 3mM bromophenol blue. Store at -20 degrees C. |
| Cell lines | |||
| 293FT cells (human) | Thermo Scientific | R70007 | |
| DNA vectors | |||
| pCMV5-Nano-CRAF WT and mutant | N/A | N/A | |
| pCMV5-14-3-3ζ-Halo | N/A | N/A | |
| Equipment | |||
| EnVision 2104 Multimode Plate Reader | PerkinElmer 2104 | 2104-0010 | 600LP NanoBRET & M460/50 nm NanoBRET emmisions filters, Luminescence 404 mirror, 6.5 mm measurement height and 0.1 s measurement time |
| Invitrogen Countess™ II Automated Cell Counter | Thermo Scientific | AMQAX1000 | |
| ThermoFisher E1-ClipTip™ Multichannel Pipettor | Thermo Scientific | 4672070 | |
| Software | |||
| GraphPad Prism (version 10.0.3) | GraphPad | www.graphpad.com | |
| Other | |||
| ThermoFisher ClipTip Multichannel pipette tips | Thermo Scientific | 94410153 | |
| Reagent Reservoir, 25 mL Divided, Sterile | Thomas Scientific | 1228K16 | |
| Perkin Elmer 384-well CulturPlate™ | PerkinElmer | 6007680 | White, polystyrene, tissue culture treated |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Scientific | C10228 |
References
- Blasco, R. B., et al. c-Raf, but not B-Raf, is essential for development of K-Ras oncogene-driven non-small cell lung carcinoma. Cancer Cell. 19, 652-663 (2011).
- Blasco, M. T., et al. Complete regression of advanced pancreatic ductal adenocarcinomas upon combined inhibition of EGFR and C-RAF. Cancer Cell. 35, 573-587 (2019).
- Karreth, F. A., Frese, K. K., DeNicola, G. M., Baccarini, M., Tuveson, D. A. C-Raf is required for the initiation of lung cancer by K-Ras(G12D). Cancer Discov. 1, 128-136 (2011).
- Lito, P., et al. Disruption of CRAF-mediated MEK activation is required for effective MEK inhibition in KRAS mutant tumors. Cancer Cell. 25, 697-710 (2014).
- Sanclemente, M., et al. c-RAF ablation induces regression of advanced Kras/Trp53 mutant lung adenocarcinomas by a mechanism independent of MAPK signaling. Cancer Cell. 33, 217-228 (2018).
- Razzaque, M. A., et al. Germline gain-of-function mutations in RAF1 cause Noonan syndrome. Nat Genet. 39, 1013-1017 (2007).
- Pandit, B., et al. Gain-of-function RAF1 mutations cause Noonan and LEOPARD syndromes with hypertrophic cardiomyopathy. Nat Genet. 39, 1007-1012 (2007).
- Terrell, E. M., Morrison, D. K. Ras-mediated activation of the Raf family kinases. Cold Spring Harb Perspect Med. 9 (1), 033746 (2019).
- Kondo, Y., et al. Cryo-EM structure of a dimeric B-Raf:14-3-3 complex reveals asymmetry in the active sites of B-Raf kinases. Science. 366, 109-115 (2019).
- Park, E., et al. Architecture of autoinhibited and active BRAF-MEK1-14-3-3 complexes. Nature. 575 (7783), 545-550 (2019).
- Tzivion, G., Luo, Z., Avruch, J. A dimeric 14-3-3 protein is an essential cofactor for Raf kinase activity. Nature. 394, 88-92 (1998).
- Spencer-Smith, R., et al. RASopathy mutations provide functional insight into the BRAF cysteine-rich domain and reveal the importance of autoinhibition in BRAF regulation. Mol Cell. 82, 4262-4276 (2022).
- Martinez Fiesco, J. A., Durrant, D. E., Morrison, D. K., Zhang, P. Structural insights into the BRAF monomer-to-dimer transition mediated by RAS binding. Nat Commun. 13, 486 (2022).
- Freeman, A. K., Ritt, D. A., Morrison, D. K. The importance of Raf dimerization in cell signaling. Small GTPases. 4, 180-185 (2013).
- Freeman, A. K., Ritt, D. A., Morrison, D. K. Effects of Raf dimerization and its inhibition on normal and disease-associated Raf signaling. Mol Cell. 49, 751-758 (2013).
- Rushworth, L. K., Hindley, A. D., O’Neill, E., Kolch, W. Regulation and role of Raf-1/B-Raf heterodimerization. Mol Cell Biol. 26, 2262-2272 (2006).
- Garnett, M. J., Rana, S., Paterson, H., Barford, D., Marais, R. Wild-type and mutant B-RAF activate C-RAF through distinct mechanisms involving heterodimerization. Mol Cell. 20, 963-969 (2005).
- Tran, N. H., Wu, X., Frost, J. A. B-Raf and Raf-1 are regulated by distinct autoregulatory mechanisms. J Biol Chem. 280, 16244-16253 (2005).
- Chong, H., Guan, K. L. Regulation of Raf through phosphorylation and N terminus-C terminus interaction. J Biol Chem. 278, 36269-36276 (2003).
- Cutler, R. E., Stephens, R. M., Saracino, M. R., Morrison, D. K. Autoregulation of the Raf-1 serine/threonine kinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 9214-9219 (1998).
- Park, E., et al. Cryo-EM structure of a RAS/RAF recruitment complex. Nat Commun. 14, 4580 (2023).
- Spencer-Smith, R., Morrison, D. K. Protocol for measuring BRAF autoinhibition in live cells using a proximity-based NanoBRET assay. STAR Protoc. 4, 102461 (2023).
- Clark, G. J., et al. 14-3-3 zeta negatively regulates raf-1 activity by interactions with the Raf-1 cysteine-rich domain. J Biol Chem. 272, 20990-20993 (1997).
- Machleidt, T., et al. NanoBRET–A novel BRET platform for the analysis of protein-protein interactions. ACS Chem Biol. 10, 1797-1804 (2015).
- Hekman, M., et al. Dynamic changes in C-Raf phosphorylation and 14-3-3 protein binding in response to growth factor stimulation: differential roles of 14-3-3 protein binding sites. J Biol Chem. 279, 14074-14086 (2004).
- Hatzivassiliou, G., et al. RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth. Nature. 464, 431-435 (2010).
- Bondzi, C., Grant, S., Krystal, G. W. A novel assay for the measurement of Raf-1 kinase activity. Oncogene. 19, 5030-5033 (2000).
- Spencer-Smith, R., et al. Inhibition of RAS function through targeting an allosteric regulatory site. Nat Chem Biol. 13 (1), 62-68 (2016).
- Roy, S., et al. 14-3-3 facilitates Ras-dependent Raf-1 activation in vitro and in vivo. Mol Cell Biol. 18, 3947-3955 (1998).
- Durrant, D. E., et al. Development of a high-throughput NanoBRET screening platform to identify modulators of the RAS/RAF interaction. Mol Cancer Ther. 20, 1743-1754 (2021).
.