Canlı Hücrelerde CRAF'ın 14-3-3 Proteinleri ile Etkileşimlerinin Ölçülmesi için Biyolüminesans Rezonans Enerji Transferi (BRET) Tabanlı Test
Summary
Bu protokol, canlı hücrelerde CRAF kinazın 14-3-3 proteinleri ile etkileşimlerini ölçmek için BRET tabanlı bir testi tanımlar. Protokol, hücrelerin hazırlanması, BRET emisyonlarının okunması ve veri analizi için adımların ana hatlarını çizmektedir. Tahlil optimizasyonu için uygun kontrollerin tanımlanması ve sorun gidermenin yer aldığı örnek bir sonuç da sunulmaktadır.
Abstract
CRAF, RAS GTPazların birincil efektörüdür ve KRAS kaynaklı çeşitli kanserlerin tümör oluşumunda kritik bir rol oynar. Ek olarak, CRAF, gelişimsel RASopati, Noonan sendromuna neden olduğu gösterilen germ hattı mutasyonları için bir sıcak noktadır. Tüm RAF kinazlar, 14-3-3 düzenleyici proteinler için çoklu fosforilasyona bağlı bağlanma bölgeleri içerir. 14-3-3’ün bu bölgelere diferansiyel bağlanması, sinyalleşme koşulları altında plazma zarında aktif RAF dimerlerinin oluşumunda ve hareketsiz koşullar altında RAF otoinhibisyonunun sürdürülmesinde önemli roller oynar. Bu etkileşimlerin nasıl düzenlendiğini ve nasıl modüle edilebileceğini anlamak, RAF fonksiyonunu hedefleyen yeni terapötik yaklaşımları belirlemek için kritik öneme sahiptir. Burada, CRAF’ın canlı hücrelerde 14-3-3 proteinleri ile etkileşimlerini ölçmek için biyolüminesans rezonans enerji transferi (BRET) tabanlı bir testi anlatıyorum. Spesifik olarak, bu tahlil, bir Nano lusiferaz donörüne kaynaşmış CRAF ve bir Halo etiket alıcısına kaynaşmış 14-3-3’ün etkileşimlerini ölçer, burada RAF ve 14-3-3’ün etkileşimi, vericiden alıcıya enerji transferi ve BRET sinyalinin üretilmesi. Protokol ayrıca, bu sinyalin, yüksek afiniteli RAF yerleştirme bölgelerinin her birine 14-3-3 bağlanmasını önlediği gösterilen mutasyonlar tarafından bozulabileceğini göstermektedir. Bu protokol, BRET emisyonlarını okumak, veri analizi yapmak ve protein ekspresyon seviyelerini doğrulamak için ayrıntılı talimatlarla birlikte hücrelerin tohumlanması, transfekte edilmesi ve yeniden kaplanması prosedürlerini açıklar. Ek olarak, optimizasyon ve sorun giderme adımlarıyla birlikte örnek tahlil sonuçları sağlanır.
Introduction
RAF kinazlar (ARAF, BRAF ve CRAF), RAS, GTPazların doğrudan efektörleri ve pro-proliferatif / pro-hayatta kalma yanlısı RAF-MEK-ERK kinaz kaskadının başlatıcı üyeleridir. Son çalışmalar, CRAF ekspresyonunun küçük hücreli dışı akciğer kanseri ve pankreas duktal adenokarsinomu 1,2,3,4,5 dahil olmak üzere KRAS kaynaklı çeşitli kanserlerin tümörijenezinde anahtar bir rol oynadığını göstermiştir. Ayrıca, germline CRAF mutasyonları, RASopati’nin özellikle şiddetli bir formu olan Noonan sendromunaneden olur 6,7. CRAF regülasyonunu anlamak, hücrelerdeki işlevini hedefleyen başarılı terapötik yaklaşımlar geliştirmek için kritik öneme sahiptir.
Tüm RAF kinazlar, aktivitesini kontrol eden bir C-terminal katalitik (CAT) alanı ve bir N-terminal düzenleyici (REG) alanı olmak üzere iki fonksiyonel alana ayrılabilir (Şekil 1A)8. REG alanı, RAS bağlama alanını (RBD), sistein açısından zengin alanı (CRD) ve serin/treonin açısından zengin bir bölgeyi (S/T-zengin) kapsar. Özellikle, S/T açısından zengin bölge, fosforilasyona bağlı bir şekilde 14-3-3’e bağlanan N’ bölgesini içerir (CRAF’ta S259; Şekil 1A) 8. CAT alanı, C’ bölgesi olarak adlandırılan ikinci bir yüksek afiniteli 14-3-3 yerleştirme bölgesi ile birlikte kinaz alanını kapsar (CRAF’ta S621; Şekil 1A) 8. Dimerik 14-3-3 proteinlerinin CRD ile birlikte N’ ve C’ bölgelerine diferansiyel bağlanması, hem RAF aktivasyonunda hem de inhibisyonda kritik rol oynar 9,10,11,12,13. Normal sinyalleşme koşulları altında, RAF aktivasyonu, RAS tarafından plazma zarına alınmasıyla başlatılır ve BRAF-CRAF heterodimerinin baskın aktif form14,15 olduğu aktif dimerler oluşturmasına izin verir. Dimerik BRAF’ın kriyojenik elektron mikroskobu (Cryo-EM) yapıları ile birlikte BRAF ve CRAF ile yapılan biyokimyasal analizler, bir 14-3-3 dimerinin, her iki RAF protomerinin C’ bölgesine aynı anda bağlanarak aktif RAF dimerlerini stabilize ettiğini göstermektedir (Şekil 1B)9,13,16,17. Tersine, çalışmalar, hareketsiz koşullar altında, RAF’ın, REG alanının CAT alanına bağlandığı veaktivitesini 12,18,19,20 inhibe ettiği sitozolik, otoinhibe edilmiş bir onay benimsediğini göstermiştir. Bu kapalı durum, REG alanındaki CRD ve N’ bölgesine ve CAT alanındaki C’ bölgesine bağlı bir 14-3-3 dimer ile stabilize edilir (Şekil 1B)10,13,21. BRAF’ta bu model, otoinhibe edilmiş BRAF monomerlerinin son Cryo-EM yapıları ve önceki biyokimyasal çalışmalarımız 10,12,13,21,22 tarafından desteklenmektedir. Bununla birlikte, 14-3-3’ün CRAF düzenlemesi23’te inhibe edici bir rol oynadığı gösterilirken, BRAF benzeri bir otoinhibe edilmiş durum, CRAF düzenlemesi12’de daha az rol oynayabilir; bu nedenle, 14-3-3 proteinlerinin CRAF aktivitesini düzenlediği mekanizmaları açıklığa kavuşturmak için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır. RAF kinazların 14-3-3 aracılı regülasyonu, çok sayıda RAF fosforilasyonu ve fosforilasyon de-fosforilasyon olayı, çeşitli düzenleyici proteinlere bağlanma ve plazma zarı8 ile etkileşimler gerektirir. Bu nedenle, 14-3-3-RAF etkileşimlerinin fizyolojik olarak ilgili koşullar altında ve sağlam bir lipid çift tabakasının varlığında ölçülmesi kritik öneme sahiptir.
Bu sorunu ele almak için, NanoBRET (bundan sonra N-BRET olarak anılacaktır; kit detayları için Malzeme Tablosuna bakınız) teknolojisi, CRAF’ın canlı hücrelerdeki 14-3-3 proteinleri ile etkileşimlerini ölçmek için yakınlık tabanlı bir test geliştirmek üzere kullanılmıştır (Şekil 1C). Bu BRET tabanlı sistem, Halo618 enerji alıcı ligand22,24 ile etiketlemek için bir proteinin bir nanolusiferaz (Nano) donörü ve diğerinin bir Halo etiketi ile etiketlendiği iki ilgilenilen proteinin (POI) etkileşimlerini ölçer. İlgilenilen proteinlerin etkileşimi, vericiden alıcıya enerji transferi ile sonuçlanır ve bu da BRET sinyalini üretir (Şekil 1C). Son derece parlak Nano donör proteini (emisyon (em) 460 nm) ve Halo618 ligandı (em 618 nm), geleneksel BRET’e göre daha fazla spektral ayırma ve hassasiyet sağlar, bu da onu daha zayıf etkileşimleri incelemek ve bağlanmadaki ince değişiklikleri tespit etmek için ideal bir platform haline getirir24. Gerçekten de, daha önce RAF REG ve CAT alanlarının otoinhibitör etkileşimlerini ölçmek için N-BRET tabanlı bir test geliştirdik, bu da BRAF CRD’deki bir RASopati mutasyonları panelinin karakterizasyonu için gerekliydi ve bu alanın otoinhibisyonu sürdürmek ve yapısal BRAF aktivasyonunu önlemek için kritik önemini gösterdik12.
Burada açıklanan tahlil, bir N-terminal Nano etiketine (Nano-CRAF) kaynaşmış CRAF ve C-terminal Halo etiketine (14-3-3ζ-Halo) kaynaşmış 14-3-3’ün zeta izoformunun etkileşimlerini ölçer; Şekil 1C). Nano-CRAF’ın 14-3-3ζ-Halo ile etkileşimlerinin sağlam bir BRET sinyali ürettiğini ve bunun da 14-3-3’ün N’ bölgesine (S259A) ve/veya C’ bölgesine (S621A) bağlanmasını önleyen mutasyonlar tarafından bozulabileceğini gösteriyoruz. Aşağıdaki protokol, bu testi gerçekleştirmek, optimize etmek ve sorun gidermek için ayrıntılı adımlar sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Önceki çalışmalar, 14-3-3 proteinlerinin RAF kinazların hem aktivasyonunda hem de inhibisyonunda kritik rol oynadığını göstermiştir. Bu bağlanma olaylarının nasıl düzenlendiğini ve bu etkileşimleri modüle etmenin RAF sinyalizasyonu ve RAF güdümlü onkogenez üzerindeki etkilerini anlamak, CRAF fonksiyonunu hedef alan yeni terapötik güvenlik açıklarını ortaya çıkarabilir. Bununla birlikte, Raf aktivasyon döngüsü, çok sayıda ilişkili protein, translasyon sonrası modifikasyonlar ve hücre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu proje kısmen Ulusal Kanser Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri’nden ZIA BC 010329 proje numarası altında federal fonlarla finanse edilmiştir.
Materials
| Antibodies | |||
| HaloTag® mouse monoclonal antibody | Promega | G9211 | Antibody for detecting HaloTag tagged proteins by immunoblot |
| NanoLuc® mouse monoclonal antibody | R&D Systems | MAB10026 | Antibody for detecting Nano-tagged proteins by immunoblot |
| CRAF mouse monoclonal antibody (E10) | Santa Crus Biotechnology | sc-7267 | Antibody directly detecting CRAF proteins by immunoblot |
| ECL anti-mouse HRP secondary antibody | Amersham | NA931-1ML | Secondary HRP conjugated mouse antibody (from sheep) |
| Reagents | |||
| X-tremeGENE™ 9 | Roche/Sigma | 6365809001 | |
| NanoBRET™ kit | Promega | N1661 | NanoBRET kit containing Halo 618 ligand and NanoGlo (nanoluciferase) substrate |
| DPBS, without Ca++ and Mg++ | Quality Biologicals | 114-057-101 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Life Technologies | 25300120 | |
| DMEM cell culture media | Life Technologies | 11995073 | High glucose, L-glutamine, phenol red, sodium pyruvate; without HEPES, suppliment media with 10% FBS, 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin |
| L-Glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030164 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140163 | |
| Opti-MEM™ I reduced serum media | Gibco | 31985062 | For cell transfection |
| Opti-MEM reduced serum media, no phenol red | Gibco | 11058021 | For replating cells on Day 3. Supplement with 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin, along with 10% FBS (where indicated). |
| Invitrogen Trypan Blue Stain | Thermo Scientific | T10282 | |
| NP40 lysis buffer | N/A | N/A | 20 mM Tris (pH 8.0), 137mM NaCl, 10% glycerol, NP40 alternative (Milipore, Cat# 492016). Store at 4 degrees C.. Add the following protease and phosphatase immediately prior to use: 20 µM leupeptin, 0.5 mM sodium orthovanidate, 0.15 U/mL, 1mM PMSF. |
| 5x gel sample buffer | N/A | N/A | 240 mM Tris (pH 8.0), 9.5% SDS, 30% glycerol, 500mM DTT, 3mM bromophenol blue. Store at -20 degrees C. |
| Cell lines | |||
| 293FT cells (human) | Thermo Scientific | R70007 | |
| DNA vectors | |||
| pCMV5-Nano-CRAF WT and mutant | N/A | N/A | |
| pCMV5-14-3-3ζ-Halo | N/A | N/A | |
| Equipment | |||
| EnVision 2104 Multimode Plate Reader | PerkinElmer 2104 | 2104-0010 | 600LP NanoBRET & M460/50 nm NanoBRET emmisions filters, Luminescence 404 mirror, 6.5 mm measurement height and 0.1 s measurement time |
| Invitrogen Countess™ II Automated Cell Counter | Thermo Scientific | AMQAX1000 | |
| ThermoFisher E1-ClipTip™ Multichannel Pipettor | Thermo Scientific | 4672070 | |
| Software | |||
| GraphPad Prism (version 10.0.3) | GraphPad | www.graphpad.com | |
| Other | |||
| ThermoFisher ClipTip Multichannel pipette tips | Thermo Scientific | 94410153 | |
| Reagent Reservoir, 25 mL Divided, Sterile | Thomas Scientific | 1228K16 | |
| Perkin Elmer 384-well CulturPlate™ | PerkinElmer | 6007680 | White, polystyrene, tissue culture treated |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Scientific | C10228 |
References
- Blasco, R. B., et al. c-Raf, but not B-Raf, is essential for development of K-Ras oncogene-driven non-small cell lung carcinoma. Cancer Cell. 19, 652-663 (2011).
- Blasco, M. T., et al. Complete regression of advanced pancreatic ductal adenocarcinomas upon combined inhibition of EGFR and C-RAF. Cancer Cell. 35, 573-587 (2019).
- Karreth, F. A., Frese, K. K., DeNicola, G. M., Baccarini, M., Tuveson, D. A. C-Raf is required for the initiation of lung cancer by K-Ras(G12D). Cancer Discov. 1, 128-136 (2011).
- Lito, P., et al. Disruption of CRAF-mediated MEK activation is required for effective MEK inhibition in KRAS mutant tumors. Cancer Cell. 25, 697-710 (2014).
- Sanclemente, M., et al. c-RAF ablation induces regression of advanced Kras/Trp53 mutant lung adenocarcinomas by a mechanism independent of MAPK signaling. Cancer Cell. 33, 217-228 (2018).
- Razzaque, M. A., et al. Germline gain-of-function mutations in RAF1 cause Noonan syndrome. Nat Genet. 39, 1013-1017 (2007).
- Pandit, B., et al. Gain-of-function RAF1 mutations cause Noonan and LEOPARD syndromes with hypertrophic cardiomyopathy. Nat Genet. 39, 1007-1012 (2007).
- Terrell, E. M., Morrison, D. K. Ras-mediated activation of the Raf family kinases. Cold Spring Harb Perspect Med. 9 (1), 033746 (2019).
- Kondo, Y., et al. Cryo-EM structure of a dimeric B-Raf:14-3-3 complex reveals asymmetry in the active sites of B-Raf kinases. Science. 366, 109-115 (2019).
- Park, E., et al. Architecture of autoinhibited and active BRAF-MEK1-14-3-3 complexes. Nature. 575 (7783), 545-550 (2019).
- Tzivion, G., Luo, Z., Avruch, J. A dimeric 14-3-3 protein is an essential cofactor for Raf kinase activity. Nature. 394, 88-92 (1998).
- Spencer-Smith, R., et al. RASopathy mutations provide functional insight into the BRAF cysteine-rich domain and reveal the importance of autoinhibition in BRAF regulation. Mol Cell. 82, 4262-4276 (2022).
- Martinez Fiesco, J. A., Durrant, D. E., Morrison, D. K., Zhang, P. Structural insights into the BRAF monomer-to-dimer transition mediated by RAS binding. Nat Commun. 13, 486 (2022).
- Freeman, A. K., Ritt, D. A., Morrison, D. K. The importance of Raf dimerization in cell signaling. Small GTPases. 4, 180-185 (2013).
- Freeman, A. K., Ritt, D. A., Morrison, D. K. Effects of Raf dimerization and its inhibition on normal and disease-associated Raf signaling. Mol Cell. 49, 751-758 (2013).
- Rushworth, L. K., Hindley, A. D., O’Neill, E., Kolch, W. Regulation and role of Raf-1/B-Raf heterodimerization. Mol Cell Biol. 26, 2262-2272 (2006).
- Garnett, M. J., Rana, S., Paterson, H., Barford, D., Marais, R. Wild-type and mutant B-RAF activate C-RAF through distinct mechanisms involving heterodimerization. Mol Cell. 20, 963-969 (2005).
- Tran, N. H., Wu, X., Frost, J. A. B-Raf and Raf-1 are regulated by distinct autoregulatory mechanisms. J Biol Chem. 280, 16244-16253 (2005).
- Chong, H., Guan, K. L. Regulation of Raf through phosphorylation and N terminus-C terminus interaction. J Biol Chem. 278, 36269-36276 (2003).
- Cutler, R. E., Stephens, R. M., Saracino, M. R., Morrison, D. K. Autoregulation of the Raf-1 serine/threonine kinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 9214-9219 (1998).
- Park, E., et al. Cryo-EM structure of a RAS/RAF recruitment complex. Nat Commun. 14, 4580 (2023).
- Spencer-Smith, R., Morrison, D. K. Protocol for measuring BRAF autoinhibition in live cells using a proximity-based NanoBRET assay. STAR Protoc. 4, 102461 (2023).
- Clark, G. J., et al. 14-3-3 zeta negatively regulates raf-1 activity by interactions with the Raf-1 cysteine-rich domain. J Biol Chem. 272, 20990-20993 (1997).
- Machleidt, T., et al. NanoBRET–A novel BRET platform for the analysis of protein-protein interactions. ACS Chem Biol. 10, 1797-1804 (2015).
- Hekman, M., et al. Dynamic changes in C-Raf phosphorylation and 14-3-3 protein binding in response to growth factor stimulation: differential roles of 14-3-3 protein binding sites. J Biol Chem. 279, 14074-14086 (2004).
- Hatzivassiliou, G., et al. RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth. Nature. 464, 431-435 (2010).
- Bondzi, C., Grant, S., Krystal, G. W. A novel assay for the measurement of Raf-1 kinase activity. Oncogene. 19, 5030-5033 (2000).
- Spencer-Smith, R., et al. Inhibition of RAS function through targeting an allosteric regulatory site. Nat Chem Biol. 13 (1), 62-68 (2016).
- Roy, S., et al. 14-3-3 facilitates Ras-dependent Raf-1 activation in vitro and in vivo. Mol Cell Biol. 18, 3947-3955 (1998).
- Durrant, D. E., et al. Development of a high-throughput NanoBRET screening platform to identify modulators of the RAS/RAF interaction. Mol Cancer Ther. 20, 1743-1754 (2021).
.