توصيل النواقل داخل القراب في الفئران اليافعة عن طريق حقن الصهريج القطني
Summary
يوصف إجراء جراحي لإجراء الحقن في الخزان القطني للفئران الأحداث. وقد استخدم هذا النهج لتوصيل نواقل العلاج الجيني داخل القراب ، ولكن من المتوقع أن يمكن استخدام هذا النهج لمجموعة متنوعة من العلاجات ، بما في ذلك الخلايا والعقاقير.
Abstract
العلاج الجيني هو تقنية قوية لتوصيل جينات جديدة للمريض لعلاج المرض ، سواء كان ذلك لإدخال جين وظيفي ، أو تعطيل جين سام ، أو توفير جين يمكن لمنتجه تعديل بيولوجيا المرض. يمكن أن تتخذ طريقة توصيل الناقل العلاجي أشكالا عديدة ، تتراوح من التسريب في الوريد للتسليم الجهازي إلى الحقن المباشر في الأنسجة المستهدفة. بالنسبة للاضطرابات التنكسية العصبية ، غالبا ما يكون من المرغوب فيه تحريف التنبيغ نحو الدماغ و / أو الحبل الشوكي. يتضمن النهج الأقل توغلا لاستهداف الجهاز العصبي المركزي بأكمله الحقن في السائل النخاعي (CSF) ، مما يسمح للعلاج بالوصول إلى جزء كبير من الجهاز العصبي المركزي. الطريقة الأكثر أمانا لتوصيل ناقل إلى السائل الدماغي الشوكي هي الحقن داخل القراب القطني ، حيث يتم إدخال إبرة في الخزان القطني للحبل الشوكي. هذه التقنية ، المعروفة أيضا باسم البزل القطني ، تستخدم على نطاق واسع في القوارض حديثي الولادة والبالغين وفي النماذج الحيوانية الكبيرة. في حين أن هذه التقنية متشابهة عبر الأنواع ومراحل النمو ، فإن الاختلافات الدقيقة في حجم وهيكل ومرونة الأنسجة المحيطة بالفضاء داخل القراب تتطلب تسهيلات في النهج. توضح هذه المقالة طريقة لإجراء البزل القطني في الفئران اليافعة لتوصيل ناقل النمط المصلي 9 المرتبط بالغدي. هنا ، تم حقن 25-35 ميكرولتر من النواقل في الصهريج القطني ، وتم استخدام مراسل البروتين الفلوري الأخضر (GFP) لتقييم ملف تعريف التنبيغ الناتج عن كل حقنة. وتناقش فوائد وتحديات هذا النهج.
Introduction
لقد تحقق أخيرا وعد العلاجات الجينية بوساطة فيروسية في السنوات الأخيرة بموافقة إدارة الغذاء والدواء الأمريكية على علاجات ضمور العضلات الشوكي وضمور الشبكية والعامل التاسع الهيموفيليا والسرطان والمزيد1،2،3،4. هناك عدد لا يحصى من العلاجات الأخرى قيد التطوير حاليا. يهدف العلاج الجيني إلى توصيل جين علاجي إلى خلايا المريض. يمكن أن تحل منتجات هذا الجين الجديد محل النشاط المفقود من جين داخلي ناقص ، أو تثبيط جين سام ، أو تقتل الخلايا السرطانية ، أو توفر بعض الوظائف المفيدة الأخرى.
بالنسبة للأمراض التي تؤثر على الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، غالبا ما يكون توصيل ناقل العلاج الجيني مباشرة إلى الأنسجة المستهدفة أمرا مرغوبا فيه. توفر النهج غير النظامية فائدتين: فهي تقلل من الآثار الجانبية غير المستهدفة التي قد تسببها عملية التنبيغ المحيطي ، وتقلل بشكل كبير من كمية الناقل اللازمة لتحقيق مستويات كافية من التنبيغ في الأنسجة المستهدفة5.
هناك مجموعة متنوعة من الأساليب لتوصيل نواقل العلاج الجيني إلى الجهاز العصبي المركزي. يمكن استخدام الحقن داخل اللحمة ، وهو حقن ناقل مباشرة في الحبل الشوكي أو أنسجة المخ ، للتوصيل إلى منطقة محددة. ومع ذلك ، بالنسبة للعديد من الأمراض ، من المرغوب فيه نقل واسع النطاق للجهاز العصبي المركزي. يمكن تحقيق ذلك عن طريق توصيل ناقل إلى السائل الدماغي الشوكي (CSF)5 ، وهو السائل الذي يتدفق داخل وحول الدماغ والحبل الشوكي. هناك ثلاث طرق أساسية لتوصيل المتجهات إلى السائل الدماغي الشوكي. النهج الأكثر توغلا هو الولادة داخل بطانة الرحم البطينية ، والتي تنطوي على حفر ثقب نتوء من خلال الجمجمة ودفع إبرة عبر الدماغ إلى البطينين الجانبيين. هذا ينتج عنه نقل في جميع أنحاء الدماغ. ومع ذلك ، قد يسبب الإجراء نزيفا داخل الجمجمة ، وينتج النهج عموما نقيضا محدودا فقط للحبل الشوكي6. الحقن في الصهريج الكبير في قاعدة الجمجمة أقل توغلا ، ولكنه ينطوي على خطر تلف جذع الدماغ. بينما يستخدم غالبا في الأبحاث على5 ، لم يعد الحقن في الصهريج ماجنا يستخدم بشكل روتيني في العيادة7. البزل القطني هو النهج الأقل توغلا للوصول إلى السائل الدماغي الشوكي. يتضمن ذلك وضع إبرة بين فقرتين قطنيتين وفي الصهريج القطني.
يتم إجراء البزل القطني لتوصيل النواقل بشكل روتيني في الجرذان والفئران البالغة وفي الفئران الوليدية 8,9. أجرى مؤلفو هذه الدراسة مؤخرا ثقوبا قطنية في الفئران اليافعة (28-30 يوما من العمر) لتوصيل ناقلات الفيروس من النمط المصلي 9 (AAV9) المرتبطة بالغدي. في الفئران البالغة ، تم وضع إبرة البزل القطني الوليدي عموديا بين الفقرات L3 و L49. ينتج عن الموضع المناسب نقرة الذيل وتدفق السائل الدماغي النخاعي إلى خزان الإبرة. في الفئران اليافعة ، على الرغم من ذلك ، لا يمكن تحقيق أي من هذه القرأات. ثم حاول المؤلفون تكييف إجراء فأر بالغ باستخدام حقنة أنسولين 27 جيجا يتم إدخالها بزاوية بين L5 و L610. في الفئران البالغة ، والتي عادة ما تكون أصغر من الفئران P28 ، لا ينتج عن ذلك نقرة ذيل ، ولكن وضع الإبرة غير الصحيح واضح من خلال التدفق العكسي للحقن. ومع ذلك ، في الفئران اليافعة ، أدى هذا النهج بشكل موحد إلى إعطاء الحقن فوق الجافية ، ومن المحتمل أن يكون ناتجا عن مرونة مختلفة بين الفئران البالغة والجرذان اليافعة لطبقات الأنسجة المحيطة بالحبل الشوكي. تم تقييم نهج القسطرة بعد ذلك. على وجه التحديد ، تم إدخال قسطرة من خلال شق في الجافية من الخزان القطني وحتى منتصف الحبل الشوكي الصدري. ومع ذلك ، أدى هذا النهج إلى ارتجاع كبير للحقن مرة أخرى من موقع الشق أثناء الولادة. كما باءت محاولات وضع القسطرة في الفضاء داخل القراب عن طريق الجلد باستخدام إبرة توجيه بالفشل. نظرا لضيق العرض بين الصفيحات ، من المحتمل أن تصطدم القسطرة بالصفيحة المنضدية وتفشل في التقدم.
هنا ، يتم وصف طريقة لتحقيق توصيل محلول ناجح وقابل للتكرار عن طريق البزل القطني في الفئران اليافعة. يمكن استخدام هذا النهج للنواقل الفيروسية ، وعلى الأرجح أيضا للخلايا والمستحضرات الصيدلانية والعلاجات الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
مجموعة واسعة من الأمراض تؤثر على الجهاز العصبي المركزي. يعد توفير نسخة وظيفية من الجين ذي الصلة عبر ناقل فيروسي استراتيجية علاجية جذابة لتلك المتنحية والأحادية المنشأ بطبيعتها ، مثل ضمور العضلات الشوكي. ومع ذلك ، فإن الحاجز الدموي الدماغي (BBB) يستبعد معظم نواقل العلاج الجيني التي تعطى عن ط…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يشكروا ستيفن جراي وماثيو ريو وناندا ريجمي ولاسي ستيرمان من UT Southwestern على مناقشة مثمرة للتحدي الذي تشكله الفئران اليافعة للحقن داخل القراب. تم دعم هذا العمل جزئيا بتمويل من جاكوار للعلاج الجيني (إلى JLFK).
Materials
| 200 µL filtered pipette tips | MidSci | PR-200RK-FL | Pipetting virus |
| AAV9-GFP | Vector Builder | P200624-1005ynr | AAV9 vector expressing GFP |
| Absorbable Suture with Needle Coated Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Size 4 – 0 Braided | McKesson | J422H | Suture |
| Bench pad | VWR | 56616-031 | Surgery |
| Braintree Scientific Isothermal Pads, 8'' x 8'' | Fisher Scientific | 50-195-4664 | Maintains body temperature |
| Buprenorphine | McKesson | 1013922 | Analgesic |
| Buprenorphine-ER (1 mg/mL) | Zoopharma | Extended-release analgesic | |
| Cotton swabs | Fisher Scientific | 19-365-409 | Blood removal |
| Drape, Mouse, Clear Plastic, 12" x 12", with Adhesive Fenestration | Steris | 1212CPSTF | Surgical drape |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Forceps |
| Electric Blanket | CVS Health | CVS Health Series 500 Extra Long Heating Pad | |
| Eppendorf Research plus, 1-channel pipette, variable, 20–200 µL | Eppendorf | 3123000055 | Pipetting virus |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | Curved surgical scissors |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | 16121-14 | Laminectomy |
| Halsey Needle Holders | Fine Science Tools | 12001-13 | Needle driver |
| Insulin Syringes with Ultra-Fine Needle 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc | BD | 328431 | Syringe |
| Isoflurane | McKesson | 803250 | Anesthetic |
| Isopropanol wipes | Fisher Scientific | 22-031-350 | Skin disinfection |
| Lidocaine, 1% | McKesson | 239935 | Local anesthesia |
| Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-137 | Loading the syringe |
| Povidone-iodine | Fisher Scientific | 50-118-0481 | Skin disinfection |
| Scalpel Handle – #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Scalpel blade holder |
| Sure-Seal Induction Chamber | Braintree Scientific | EZ-17 | Anesthesia box |
| Surgical Blade Miltex Carbon Steel No. 11 Sterile Disposable Individually Wrapped | McKesson | 4-111 | #11 Scalpel blade |
| SYSTANE NIGHTTIME Eye Ointment | Alcon | Eye ointment | |
| Trypan Blue | VWR | 97063-702 | Injection |
References
- Wurster, C., Petri, S. Progress in spinal muscular atrophy research. Curr Opin Neurol. 35 (5), 693-698 (2022).
- Wu, K. Y., et al. Retinitis pigmentosa: Novel therapeutic targets and drug development. Pharmaceutics. 15 (2), 685 (2023).
- Larkin, H. First FDA-approved gene therapy for hemophilia. JAMA. 329 (1), 14 (2023).
- Lee, A. Nadofaragene firadenovec: First approval. Drugs. 83 (4), 353-357 (2023).
- Taghian, T., et al. A safe and reliable technique for CNS delivery of AAV vectors in the cisterna magna. Mol Ther. 28 (2), 411-421 (2020).
- Donsante, A., et al. Intracerebroventricular delivery of self-complementary adeno-associated virus serotype 9 to the adult rat brain. Gene Ther. 23 (5), 401-407 (2016).
- Pellot, J. E., Jesus, O. D. Suboccipital puncture. [Updated 2022 Jul 25]. StatPearls [Internet]. , (2022).
- Elliger, S. S., Elliger, C. A., Aguilar, C. P., Raju, N. R., Watson, G. L. Elimination of lysosomal storage in brains of MPS vii mice treated by intrathecal administration of an adeno-associated virus vector. Gene Ther. 6 (6), 1175-1178 (1999).
- De La Calle, J. L., Paino, C. L. A procedure for direct lumbar puncture in rats. Brain Res Bull. 59 (3), 245-250 (2002).
- O’connor, D. M., Lutomski, C., Jarrold, M. F., Boulis, N. M., Donsante, A. Lot-to-lot variation in adeno-associated virus serotype 9 (AAV9) preparations. Hum Gene Ther Methods. 30 (6), 214-225 (2019).
- Manfredsson, F. P., Rising, A. C., Mandel, R. J. AAV9: A potential blood-brain barrier buster. Mol Ther. 17 (3), 403-405 (2009).
- Hudry, E., Vandenberghe, L. H. Therapeutic AAV gene transfer to the nervous system: A clinical reality. Neuron. 101 (5), 839-862 (2019).
- Georg-Fries, B., Biederlack, S., Wolf, J., Zur Hausen, H. Analysis of proteins, helper dependence, and seroepidemiology of a new human parvovirus. Virology. 134 (1), 64-71 (1984).
- Schulz, M., et al. Binding and neutralizing anti-aav antibodies: Detection and implications for rAAV-mediated gene therapy. Mol Ther. 31 (3), 616-630 (2023).
- Gray, S. J., Nagabhushan Kalburgi, S., Mccown, T. J., Samulski, J. R. Global CNS gene delivery and evasion of anti-aav-neutralizing antibodies by intrathecal aav administration in non-human primates. Gene Ther. 20 (4), 450-459 (2013).
- Meyer, K., et al. Improving single injection CSF delivery of AAV9-mediated gene therapy for sma: A dose-response study in mice and non-human primates. Mol Ther. 23 (3), 477-487 (2015).
- Hinderer, C., et al. Evaluation of intrathecal routes of administration for adeno-associated viral vectors in large animals. Hum Gene Ther. 29 (1), 15-24 (2018).
- Wang, Y. F., et al. Cerebrospinal fluid leakage and headache after lumbar puncture: A prospective non-invasive imaging study. Brain. 138, 1492-1498 (2015).
- Hordeaux, J., et al. Adeno-associated virus-induced dorsal root ganglion pathology). Hum Gene Ther. 31 (15-16), 808-818 (2020).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 106-107, 1-16 (2013).
- Fang, H., et al. Comparison of adeno-associated virus serotypes and delivery methods for cardiac gene transfer. Hum Gene Ther Methods. 23 (4), 234-241 (2012).
.