Intratekal vektorlevering hos unge rotter via lumbal cisterninjektion
Summary
Et kirurgisk indgreb er beskrevet for at udføre injektioner i lændecisternen hos den unge rotte. Denne tilgang er blevet brugt til intratekal levering af genterapivektorer, men det forventes, at denne tilgang kan bruges til en række forskellige terapier, herunder celler og lægemidler.
Abstract
Genterapi er en kraftfuld teknologi til at levere nye gener til en patient til behandling af sygdom, hvad enten det er at introducere et funktionelt gen, inaktivere et giftigt gen eller tilvejebringe et gen, hvis produkt kan modulere sygdommens biologi. Leveringsmetoden for den terapeutiske vektor kan antage mange former, lige fra intravenøs infusion til systemisk levering til direkte injektion i målvævet. Ved neurodegenerative lidelser er det ofte ønskeligt at skævvride transduktionen mod hjernen og/eller rygmarven. Den mindst invasive tilgang til at målrette mod hele centralnervesystemet involverer injektion i cerebrospinalvæsken (CSF), hvilket gør det muligt for terapien at nå en stor del af centralnervesystemet. Den sikreste tilgang til at levere en vektor ind i CSF er den lumbale intratekale injektion, hvor en nål indføres i rygmarvens lændecistern. Denne teknik, også kendt som en lumbalpunktur, er blevet meget brugt i neonatale og voksne gnavere og i store dyremodeller. Mens teknikken er ens på tværs af arter og udviklingsstadier, kræver subtile forskelle i størrelse, struktur og elasticitet af væv, der omgiver det intratekale rum, tilpasninger i tilgangen. Denne artikel beskriver en metode til at udføre lumbalpunktur hos unge rotter for at levere en adeno-associeret serotype 9-vektor. Her blev 25-35 μL vektor injiceret i lændecisternen, og en grøn fluorescerende protein (GFP) reporter blev brugt til at evaluere transduktionsprofilen som følge af hver injektion. Fordelene og udfordringerne ved denne tilgang diskuteres.
Introduction
Løftet om viralmedierede genterapier er endelig blevet realiseret i de senere år med FDA’s godkendelse af behandlinger for spinal muskelatrofi, retinal dystrofi, faktor IX hæmofili, kræft og mere 1,2,3,4. Utallige andre behandlinger er i øjeblikket under udvikling. Genterapi har til formål at levere et terapeutisk gen til en patients celler. Produkterne af dette nye gen kan erstatte den manglende aktivitet fra et mangelfuldt endogent gen, hæmme et giftigt gen, dræbe kræftceller eller give en anden gavnlig funktion.
For sygdomme, der påvirker centralnervesystemet (CNS), er det ofte ønskeligt at levere genterapivektoren direkte til målvævet. Ikke-systemiske tilgange giver to fordele: de minimerer bivirkninger uden for målet, der kan være forårsaget af perifer transduktion, og de reducerer i høj grad mængden af vektor, der er nødvendig for at opnå tilstrækkelige transduktionsniveauer i målvævet5.
Der er en række forskellige tilgange til at levere genterapivektorer til CNS. Intraparenkymal injektion, injektion af en vektor direkte i rygmarven eller hjernevævet, kan bruges til levering til et defineret område. For mange sygdomme ønskes imidlertid bred transduktion af CNS. Dette kan opnås ved at levere en vektor til cerebrospinalvæsken (CSF)5, væsken, der strømmer i og omkring hjernen og rygmarven. Der er tre primære måder at levere vektorer til CSF på. Den mest invasive tilgang er intracerebroventrikulær levering, som involverer at bore et hul gennem kraniet og føre en nål gennem hjernen ind i de laterale ventrikler. Dette giver transduktion i hele hjernen. Indgrebet kan dog forårsage intrakraniel blødning, og tilgangen giver generelt kun begrænset transduktion af rygmarven6. Injektion i cisterna magna i bunden af kraniet er mindre invasiv, men medfører risiko for skade på hjernestammen. Mens det ofte bruges i dyreforsøg5, bruges injektion i cisterna magna ikke længere rutinemæssigt i klinikken7. Lumbalpunktur er den mindst invasive tilgang til at få adgang til CSF. Dette indebærer at placere en nål mellem to lændehvirvler og ind i lændecisternen.
Lumbalpunktur til vektorlevering udføres rutinemæssigt hos voksne rotter og mus og hos neonatale mus 8,9. Forfatterne af denne undersøgelse udførte for nylig lumbalpunkturer hos unge rotter (28-30 dages alderen) for at levere adeno-associerede virus serotype 9 (AAV9) vektorer. Hos voksne rotter blev en neonatal lumbalpunkturnål placeret lodret mellem L3- og L4-ryghvirvlerne9. Korrekt placering resulterer i et halesvirp og CSF, der strømmer op i nålebeholderen. Hos unge rotter kunne ingen af disse udlæsninger dog opnås. Forfatterne forsøgte derefter at tilpasse en voksen museprocedure ved hjælp af en 27 G insulinsprøjte indsat i en vinkel mellem L5 og L610. Hos voksne mus, som typisk er mindre end P28-rotter, giver dette ikke et haleslag, men forkert nåleplacering er tydelig ved tilbagestrømningen af injektatet. Hos unge rotter førte denne tilgang imidlertid ensartet til, at injiceret blev leveret epiduralt, sandsynligvis som følge af forskellig elasticitet mellem voksne mus og unge rotter i vævslagene omkring rygmarven. Katetertilgange blev derefter evalueret. Specifikt blev et kateter indført gennem et snit i lumbalcisternens dura og op til den midterste thorax rygmarv; Denne tilgang førte dog til betydelig tilbagesvaling af injiceret tilbage ud af snitstedet under fødslen. Forsøg på at placere kateteret i det intratekale rum perkutant ved hjælp af en guidenål var heller ikke forgæves. På grund af den smalle interlaminærbredde vil kateteret sandsynligvis ramme rostral lamina og ikke komme frem.
Her beskrives en metode til at opnå vellykket og reproducerbar opløsningslevering via en lumbalpunktur hos den unge rotte. Denne tilgang kan bruges til virale vektorer og sandsynligvis også til celler, lægemidler og andre terapier.
Protocol
Representative Results
Discussion
En lang række sygdomme påvirker CNS. At give en funktionel kopi af det relevante gen via en viral vektor er en attraktiv behandlingsstrategi for dem, der er recessive og monogene af natur, såsom spinal muskelatrofi. Blod-hjerne-barrieren (BBB) udelukker dog de fleste genterapivektorer, der gives intravenøst11. De, der kan krydse BBB, såsom AAV9, skal gives i høje doser for at overvinde vektortabet på grund af perifer transduktion12. Alderen er også en barriere. Milj…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Steven Gray, Matthew Rioux, Nanda Regmi og Lacey Stearman fra UT Southwestern for en produktiv diskussion af udfordringen med unge rotter til intratekal injektion. Dette arbejde blev delvist støttet af finansiering fra Jaguar Gene Therapy (til JLFK).
Materials
| 200 µL filtered pipette tips | MidSci | PR-200RK-FL | Pipetting virus |
| AAV9-GFP | Vector Builder | P200624-1005ynr | AAV9 vector expressing GFP |
| Absorbable Suture with Needle Coated Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Size 4 – 0 Braided | McKesson | J422H | Suture |
| Bench pad | VWR | 56616-031 | Surgery |
| Braintree Scientific Isothermal Pads, 8'' x 8'' | Fisher Scientific | 50-195-4664 | Maintains body temperature |
| Buprenorphine | McKesson | 1013922 | Analgesic |
| Buprenorphine-ER (1 mg/mL) | Zoopharma | Extended-release analgesic | |
| Cotton swabs | Fisher Scientific | 19-365-409 | Blood removal |
| Drape, Mouse, Clear Plastic, 12" x 12", with Adhesive Fenestration | Steris | 1212CPSTF | Surgical drape |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Forceps |
| Electric Blanket | CVS Health | CVS Health Series 500 Extra Long Heating Pad | |
| Eppendorf Research plus, 1-channel pipette, variable, 20–200 µL | Eppendorf | 3123000055 | Pipetting virus |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | Curved surgical scissors |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | 16121-14 | Laminectomy |
| Halsey Needle Holders | Fine Science Tools | 12001-13 | Needle driver |
| Insulin Syringes with Ultra-Fine Needle 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc | BD | 328431 | Syringe |
| Isoflurane | McKesson | 803250 | Anesthetic |
| Isopropanol wipes | Fisher Scientific | 22-031-350 | Skin disinfection |
| Lidocaine, 1% | McKesson | 239935 | Local anesthesia |
| Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-137 | Loading the syringe |
| Povidone-iodine | Fisher Scientific | 50-118-0481 | Skin disinfection |
| Scalpel Handle – #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Scalpel blade holder |
| Sure-Seal Induction Chamber | Braintree Scientific | EZ-17 | Anesthesia box |
| Surgical Blade Miltex Carbon Steel No. 11 Sterile Disposable Individually Wrapped | McKesson | 4-111 | #11 Scalpel blade |
| SYSTANE NIGHTTIME Eye Ointment | Alcon | Eye ointment | |
| Trypan Blue | VWR | 97063-702 | Injection |
References
- Wurster, C., Petri, S. Progress in spinal muscular atrophy research. Curr Opin Neurol. 35 (5), 693-698 (2022).
- Wu, K. Y., et al. Retinitis pigmentosa: Novel therapeutic targets and drug development. Pharmaceutics. 15 (2), 685 (2023).
- Larkin, H. First FDA-approved gene therapy for hemophilia. JAMA. 329 (1), 14 (2023).
- Lee, A. Nadofaragene firadenovec: First approval. Drugs. 83 (4), 353-357 (2023).
- Taghian, T., et al. A safe and reliable technique for CNS delivery of AAV vectors in the cisterna magna. Mol Ther. 28 (2), 411-421 (2020).
- Donsante, A., et al. Intracerebroventricular delivery of self-complementary adeno-associated virus serotype 9 to the adult rat brain. Gene Ther. 23 (5), 401-407 (2016).
- Pellot, J. E., Jesus, O. D. Suboccipital puncture. [Updated 2022 Jul 25]. StatPearls [Internet]. , (2022).
- Elliger, S. S., Elliger, C. A., Aguilar, C. P., Raju, N. R., Watson, G. L. Elimination of lysosomal storage in brains of MPS vii mice treated by intrathecal administration of an adeno-associated virus vector. Gene Ther. 6 (6), 1175-1178 (1999).
- De La Calle, J. L., Paino, C. L. A procedure for direct lumbar puncture in rats. Brain Res Bull. 59 (3), 245-250 (2002).
- O’connor, D. M., Lutomski, C., Jarrold, M. F., Boulis, N. M., Donsante, A. Lot-to-lot variation in adeno-associated virus serotype 9 (AAV9) preparations. Hum Gene Ther Methods. 30 (6), 214-225 (2019).
- Manfredsson, F. P., Rising, A. C., Mandel, R. J. AAV9: A potential blood-brain barrier buster. Mol Ther. 17 (3), 403-405 (2009).
- Hudry, E., Vandenberghe, L. H. Therapeutic AAV gene transfer to the nervous system: A clinical reality. Neuron. 101 (5), 839-862 (2019).
- Georg-Fries, B., Biederlack, S., Wolf, J., Zur Hausen, H. Analysis of proteins, helper dependence, and seroepidemiology of a new human parvovirus. Virology. 134 (1), 64-71 (1984).
- Schulz, M., et al. Binding and neutralizing anti-aav antibodies: Detection and implications for rAAV-mediated gene therapy. Mol Ther. 31 (3), 616-630 (2023).
- Gray, S. J., Nagabhushan Kalburgi, S., Mccown, T. J., Samulski, J. R. Global CNS gene delivery and evasion of anti-aav-neutralizing antibodies by intrathecal aav administration in non-human primates. Gene Ther. 20 (4), 450-459 (2013).
- Meyer, K., et al. Improving single injection CSF delivery of AAV9-mediated gene therapy for sma: A dose-response study in mice and non-human primates. Mol Ther. 23 (3), 477-487 (2015).
- Hinderer, C., et al. Evaluation of intrathecal routes of administration for adeno-associated viral vectors in large animals. Hum Gene Ther. 29 (1), 15-24 (2018).
- Wang, Y. F., et al. Cerebrospinal fluid leakage and headache after lumbar puncture: A prospective non-invasive imaging study. Brain. 138, 1492-1498 (2015).
- Hordeaux, J., et al. Adeno-associated virus-induced dorsal root ganglion pathology). Hum Gene Ther. 31 (15-16), 808-818 (2020).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 106-107, 1-16 (2013).
- Fang, H., et al. Comparison of adeno-associated virus serotypes and delivery methods for cardiac gene transfer. Hum Gene Ther Methods. 23 (4), 234-241 (2012).
.