Intrathecale vectortoediening bij jonge ratten via lumbale stortbakinjectie
Summary
Een chirurgische ingreep wordt beschreven om injecties uit te voeren in de lumbale stortbak van de jonge rat. Deze benadering is gebruikt voor de intrathecale toediening van gentherapievectoren, maar er wordt verwacht dat deze benadering kan worden gebruikt voor een verscheidenheid aan therapieën, waaronder cellen en medicijnen.
Abstract
Gentherapie is een krachtige technologie om nieuwe genen aan een patiënt af te leveren voor de behandeling van ziekten, of het nu gaat om het introduceren van een functioneel gen, het inactiveren van een toxisch gen of het leveren van een gen waarvan het product de biologie van de ziekte kan moduleren. De toedieningsmethode voor de therapeutische vector kan vele vormen aannemen, variërend van intraveneuze infusie voor systemische toediening tot directe injectie in het doelweefsel. Voor neurodegeneratieve aandoeningen is het vaak wenselijk om de transductie naar de hersenen en/of het ruggenmerg te verschuiven. De minst invasieve benadering om het hele centrale zenuwstelsel aan te pakken, is injectie in de cerebrospinale vloeistof (CSF), waardoor het geneesmiddel een groot deel van het centrale zenuwstelsel kan bereiken. De veiligste manier om een vector in de liquor af te leveren, is de lumbale intrathecale injectie, waarbij een naald in de lumbale stortbak van het ruggenmerg wordt ingebracht. Deze techniek, ook wel lumbaalpunctie genoemd, wordt veel gebruikt bij neonatale en volwassen knaagdieren en in grote diermodellen. Hoewel de techniek vergelijkbaar is tussen soorten en ontwikkelingsstadia, vereisen subtiele verschillen in grootte, structuur en elasticiteit van weefsels rond de intrathecale ruimte aanpassingen in de aanpak. Dit artikel beschrijft een methode voor het uitvoeren van lumbaalpunctie bij jonge ratten om een adeno-geassocieerde serotype 9-vector af te leveren. Hier werd 25-35 μL vector in de lumbale stortbak geïnjecteerd en werd een groen fluorescerend eiwit (GFP) reporter gebruikt om het transductieprofiel van elke injectie te evalueren. De voordelen en uitdagingen van deze aanpak worden besproken.
Introduction
De belofte van viraal-gemedieerde gentherapieën is de afgelopen jaren eindelijk gerealiseerd met de FDA-goedkeuring van behandelingen voor spinale musculaire atrofie, retinale dystrofie, factor IX hemofilie, kanker en meer 1,2,3,4. Talloze andere therapieën zijn momenteel in ontwikkeling. Gentherapie heeft tot doel een therapeutisch gen af te leveren aan de cellen van een patiënt. De producten van dit nieuwe gen kunnen de ontbrekende activiteit van een gebrekkig endogeen gen vervangen, een toxisch gen remmen, kankercellen doden of een andere gunstige functie bieden.
Voor ziekten die het centrale zenuwstelsel (CZS) aantasten, is het vaak wenselijk om de gentherapievector rechtstreeks aan het doelweefsel af te leveren. Niet-systemische benaderingen bieden twee voordelen: ze minimaliseren off-target bijwerkingen die kunnen worden veroorzaakt door perifere transductie, en ze verminderen de hoeveelheid vector die nodig is om adequate niveaus van transductie in hetdoelweefsel te bereiken aanzienlijk.
Er zijn verschillende benaderingen voor het afleveren van gentherapievectoren aan het CZS. Intraparenchymale injectie, de injectie van een vector rechtstreeks in het ruggenmerg of hersenweefsel, kan worden gebruikt voor toediening aan een bepaald gebied. Voor veel ziekten is echter een brede transductie van het CZS gewenst. Dit kan worden bereikt door een vector af te leveren aan de cerebrospinale vloeistof (CSF)5, de vloeistof die in en rond de hersenen en het ruggenmerg stroomt. Er zijn drie primaire manieren om vectoren aan de CSF te leveren. De meest invasieve benadering is intracerebroventriculaire toediening, waarbij een braamgat door de schedel wordt geboord en een naald door de hersenen in de laterale ventrikels wordt gebracht. Dit levert transductie op door de hele hersenen. De procedure kan echter intracraniële bloeding veroorzaken en de aanpak produceert over het algemeen slechts een beperkte transductie van het ruggenmerg6. Injectie in de cisterna magna aan de basis van de schedel is minder invasief, maar brengt het risico van schade aan de hersenstam met zich mee. Hoewel injectie in de cisterna magna vaak wordt gebruikt in dieronderzoek5, wordt het niet langer routinematig gebruikt in de kliniek7. Lumbaalpunctie is de minst invasieve benadering om toegang te krijgen tot de CSF. Dit omvat het plaatsen van een naald tussen twee lendenwervels en in de lumbale stortbak.
Lumbaalpunctie voor vectorafgifte wordt routinematig uitgevoerd bij volwassen ratten en muizen en bij neonatale muizen 8,9. De auteurs van deze studie hebben onlangs lumbaalpuncties uitgevoerd bij jonge ratten (28-30 dagen oud) om adeno-geassocieerde virusserotype 9 (AAV9) vectoren af te leveren. Bij volwassen ratten werd een neonatale lumbaalpunctienaald verticaal tussen de wervels L3 en L4 9geplaatst. De juiste plaatsing resulteert in een staartbeweging en CSF die omhoog stroomt in het naaldreservoir. Bij jonge ratten kon echter geen van deze uitlezingen worden bereikt. De auteurs probeerden vervolgens een procedure voor volwassen muizen aan te passen met behulp van een insulinespuit van 27 G die onder een hoek tussen L5 en L6 werd ingebracht10. Bij volwassen muizen, die doorgaans kleiner zijn dan P28-ratten, produceert dit geen staartbeweging, maar een onjuiste plaatsing van de naald is duidelijk te zien aan de terugstroming van het injectiemiddel. Bij juveniele ratten leidde deze aanpak er echter uniform toe dat het injectaat epiduraal werd toegediend, waarschijnlijk als gevolg van een verschillende elasticiteit tussen volwassen muizen en juveniele ratten van de weefsellagen rond het ruggenmerg. Vervolgens werden katheterbenaderingen geëvalueerd. In het bijzonder werd een katheter ingebracht via een incisie in de dura van de lumbale stortbak en tot aan het midden van het thoracale ruggenmerg; Deze aanpak leidde echter tot een aanzienlijke terugvloeiing van het injectaat uit de incisieplaats tijdens de bevalling. Pogingen om de katheter percutaan in de intrathecale ruimte te plaatsen met behulp van een geleidingsnaald waren ook niet succesvol. Vanwege de smalheid van de interlaminaire breedte zou de katheter waarschijnlijk de rostrale lamina raken en niet vooruitgaan.
Hier wordt een methode beschreven om een succesvolle en reproduceerbare toediening van de oplossing te bereiken via een lumbaalpunctie bij de jonge rat. Deze aanpak kan worden gebruikt voor virale vectoren, en waarschijnlijk ook voor cellen, geneesmiddelen en andere therapieën.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een breed scala aan ziekten tast het CZS aan. Het verstrekken van een functionele kopie van het relevante gen via een virale vector is een aantrekkelijke behandelingsstrategie voor recessieve en monogene genen, zoals spinale musculaire atrofie. De bloed-hersenbarrière (BBB) sluit echter de meeste gentherapievectoren uit die intraveneus worden toegediend11. Degenen die de BBB kunnen kruisen, zoals AAV9, moeten in hoge doses worden gegeven om het vectorverlies als gevolg van perifere transductie te…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Steven Gray, Matthew Rioux, Nanda Regmi en Lacey Stearman van UT Southwestern bedanken voor een productieve discussie over de uitdaging van jonge ratten voor intrathecale injectie. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door financiering van Jaguar Gene Therapy (aan JLFK).
Materials
| 200 µL filtered pipette tips | MidSci | PR-200RK-FL | Pipetting virus |
| AAV9-GFP | Vector Builder | P200624-1005ynr | AAV9 vector expressing GFP |
| Absorbable Suture with Needle Coated Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Size 4 – 0 Braided | McKesson | J422H | Suture |
| Bench pad | VWR | 56616-031 | Surgery |
| Braintree Scientific Isothermal Pads, 8'' x 8'' | Fisher Scientific | 50-195-4664 | Maintains body temperature |
| Buprenorphine | McKesson | 1013922 | Analgesic |
| Buprenorphine-ER (1 mg/mL) | Zoopharma | Extended-release analgesic | |
| Cotton swabs | Fisher Scientific | 19-365-409 | Blood removal |
| Drape, Mouse, Clear Plastic, 12" x 12", with Adhesive Fenestration | Steris | 1212CPSTF | Surgical drape |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Forceps |
| Electric Blanket | CVS Health | CVS Health Series 500 Extra Long Heating Pad | |
| Eppendorf Research plus, 1-channel pipette, variable, 20–200 µL | Eppendorf | 3123000055 | Pipetting virus |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | Curved surgical scissors |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | 16121-14 | Laminectomy |
| Halsey Needle Holders | Fine Science Tools | 12001-13 | Needle driver |
| Insulin Syringes with Ultra-Fine Needle 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc | BD | 328431 | Syringe |
| Isoflurane | McKesson | 803250 | Anesthetic |
| Isopropanol wipes | Fisher Scientific | 22-031-350 | Skin disinfection |
| Lidocaine, 1% | McKesson | 239935 | Local anesthesia |
| Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-137 | Loading the syringe |
| Povidone-iodine | Fisher Scientific | 50-118-0481 | Skin disinfection |
| Scalpel Handle – #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Scalpel blade holder |
| Sure-Seal Induction Chamber | Braintree Scientific | EZ-17 | Anesthesia box |
| Surgical Blade Miltex Carbon Steel No. 11 Sterile Disposable Individually Wrapped | McKesson | 4-111 | #11 Scalpel blade |
| SYSTANE NIGHTTIME Eye Ointment | Alcon | Eye ointment | |
| Trypan Blue | VWR | 97063-702 | Injection |
References
- Wurster, C., Petri, S. Progress in spinal muscular atrophy research. Curr Opin Neurol. 35 (5), 693-698 (2022).
- Wu, K. Y., et al. Retinitis pigmentosa: Novel therapeutic targets and drug development. Pharmaceutics. 15 (2), 685 (2023).
- Larkin, H. First FDA-approved gene therapy for hemophilia. JAMA. 329 (1), 14 (2023).
- Lee, A. Nadofaragene firadenovec: First approval. Drugs. 83 (4), 353-357 (2023).
- Taghian, T., et al. A safe and reliable technique for CNS delivery of AAV vectors in the cisterna magna. Mol Ther. 28 (2), 411-421 (2020).
- Donsante, A., et al. Intracerebroventricular delivery of self-complementary adeno-associated virus serotype 9 to the adult rat brain. Gene Ther. 23 (5), 401-407 (2016).
- Pellot, J. E., Jesus, O. D. Suboccipital puncture. [Updated 2022 Jul 25]. StatPearls [Internet]. , (2022).
- Elliger, S. S., Elliger, C. A., Aguilar, C. P., Raju, N. R., Watson, G. L. Elimination of lysosomal storage in brains of MPS vii mice treated by intrathecal administration of an adeno-associated virus vector. Gene Ther. 6 (6), 1175-1178 (1999).
- De La Calle, J. L., Paino, C. L. A procedure for direct lumbar puncture in rats. Brain Res Bull. 59 (3), 245-250 (2002).
- O’connor, D. M., Lutomski, C., Jarrold, M. F., Boulis, N. M., Donsante, A. Lot-to-lot variation in adeno-associated virus serotype 9 (AAV9) preparations. Hum Gene Ther Methods. 30 (6), 214-225 (2019).
- Manfredsson, F. P., Rising, A. C., Mandel, R. J. AAV9: A potential blood-brain barrier buster. Mol Ther. 17 (3), 403-405 (2009).
- Hudry, E., Vandenberghe, L. H. Therapeutic AAV gene transfer to the nervous system: A clinical reality. Neuron. 101 (5), 839-862 (2019).
- Georg-Fries, B., Biederlack, S., Wolf, J., Zur Hausen, H. Analysis of proteins, helper dependence, and seroepidemiology of a new human parvovirus. Virology. 134 (1), 64-71 (1984).
- Schulz, M., et al. Binding and neutralizing anti-aav antibodies: Detection and implications for rAAV-mediated gene therapy. Mol Ther. 31 (3), 616-630 (2023).
- Gray, S. J., Nagabhushan Kalburgi, S., Mccown, T. J., Samulski, J. R. Global CNS gene delivery and evasion of anti-aav-neutralizing antibodies by intrathecal aav administration in non-human primates. Gene Ther. 20 (4), 450-459 (2013).
- Meyer, K., et al. Improving single injection CSF delivery of AAV9-mediated gene therapy for sma: A dose-response study in mice and non-human primates. Mol Ther. 23 (3), 477-487 (2015).
- Hinderer, C., et al. Evaluation of intrathecal routes of administration for adeno-associated viral vectors in large animals. Hum Gene Ther. 29 (1), 15-24 (2018).
- Wang, Y. F., et al. Cerebrospinal fluid leakage and headache after lumbar puncture: A prospective non-invasive imaging study. Brain. 138, 1492-1498 (2015).
- Hordeaux, J., et al. Adeno-associated virus-induced dorsal root ganglion pathology). Hum Gene Ther. 31 (15-16), 808-818 (2020).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 106-107, 1-16 (2013).
- Fang, H., et al. Comparison of adeno-associated virus serotypes and delivery methods for cardiac gene transfer. Hum Gene Ther Methods. 23 (4), 234-241 (2012).
.