Administration intrathécale de vecteurs chez des rats juvéniles par injection dans une citerne lombaire
Summary
Une intervention chirurgicale est décrite pour effectuer des injections dans la citerne lombaire du rat juvénile. Cette approche a été utilisée pour l’administration intrathécale de vecteurs de thérapie génique, mais on s’attend à ce qu’elle puisse être utilisée pour une variété de traitements, y compris les cellules et les médicaments.
Abstract
La thérapie génique est une technologie puissante pour fournir de nouveaux gènes à un patient pour le traitement d’une maladie, qu’il s’agisse d’introduire un gène fonctionnel, d’inactiver un gène toxique ou de fournir un gène dont le produit peut moduler la biologie de la maladie. La méthode d’administration du vecteur thérapeutique peut prendre de nombreuses formes, allant de la perfusion intraveineuse pour une administration systémique à l’injection directe dans le tissu cible. Pour les troubles neurodégénératifs, il est souvent souhaitable d’incliner la transduction vers le cerveau et/ou la moelle épinière. L’approche la moins invasive pour cibler l’ensemble du système nerveux central consiste à injecter dans le liquide céphalo-rachidien (LCR), ce qui permet au traitement d’atteindre une grande partie du système nerveux central. L’approche la plus sûre pour administrer un vecteur dans le LCR est l’injection intrathécale lombaire, où une aiguille est introduite dans la citerne lombaire de la moelle épinière. Cette technique, également connue sous le nom de ponction lombaire, a été largement utilisée chez les rongeurs néonatals et adultes et dans les modèles de grands animaux. Bien que la technique soit similaire entre les espèces et les stades de développement, des différences subtiles de taille, de structure et d’élasticité des tissus entourant l’espace intrathécal nécessitent des adaptations dans l’approche. Cet article décrit une méthode permettant d’effectuer une ponction lombaire chez des rats juvéniles afin d’administrer un vecteur de sérotype 9 adéno-associé. Ici, 25 à 35 μL de vecteur ont été injectés dans la citerne lombaire, et un rapporteur de protéine fluorescente verte (GFP) a été utilisé pour évaluer le profil de transduction résultant de chaque injection. Les avantages et les défis de cette approche sont discutés.
Introduction
La promesse des thérapies géniques à médiation virale s’est finalement concrétisée ces dernières années avec l’approbation par la FDA de traitements pour l’amyotrophie spinale, la dystrophie rétinienne, l’hémophilie par facteur IX, le cancer, etc. D’innombrables autres traitements sont actuellement en cours de développement. La thérapie génique vise à délivrer un gène thérapeutique aux cellules d’un patient. Les produits de ce nouveau gène peuvent remplacer l’activité manquante d’un gène endogène déficient, inhiber un gène toxique, tuer les cellules cancéreuses ou fournir une autre fonction bénéfique.
Pour les maladies affectant le système nerveux central (SNC), il est souvent souhaitable d’administrer le vecteur de thérapie génique directement au tissu cible. Les approches non systémiques offrent deux avantages : elles minimisent les effets secondaires hors cible qui peuvent être causés par la transduction périphérique, et elles réduisent considérablement la quantité de vecteur nécessaire pour atteindre des niveaux adéquats de transduction dans le tissu cible5.
Il existe une variété d’approches pour administrer des vecteurs de thérapie génique au SNC. L’injection intraparenchymateuse, c’est-à-dire l’injection d’un vecteur directement dans la moelle épinière ou le tissu cérébral, peut être utilisée pour l’administration dans une région définie. Cependant, pour de nombreuses maladies, une large transduction du SNC est souhaitée. Cela peut être accompli en délivrant un vecteur dans le liquide céphalo-rachidien (LCR)5, le liquide qui circule dans et autour du cerveau et de la moelle épinière. Il existe trois façons principales d’acheminer des vecteurs vers la PPC. L’approche la plus invasive est l’administration intra-ventriculaire, qui consiste à percer un trou de bavure à travers le crâne et à faire avancer une aiguille à travers le cerveau dans les ventricules latéraux. Cela produit une transduction dans tout le cerveau. Cependant, la procédure peut provoquer une hémorragie intracrânienne, et l’approche ne produit généralement qu’une transduction limitée de la moelle épinière6. L’injection dans la citerne magna à la base du crâne est moins invasive, mais comporte un risque de lésions du tronc cérébral. Bien qu’elle soit souvent utilisée dans la recherche animale5, l’injection dans la citerne magna n’est plus utilisée systématiquement en clinique7. La ponction lombaire est l’approche la moins invasive pour accéder au LCR. Il s’agit de placer une aiguille entre deux vertèbres lombaires et dans la citerne lombaire.
La ponction lombaire pour l’administration de vecteurs est couramment pratiquée chez les rats et les souris adultes et chez les souris néonatales 8,9. Les auteurs de cette étude ont récemment effectué des ponctions lombaires chez des rats juvéniles (âgés de 28 à 30 jours) pour administrer des vecteurs du virus adéno-associé de sérotype 9 (AAV9). Chez des rats adultes, une aiguille de ponction lombaire néonatale a été placée verticalement entre les vertèbres L3 et L49. Un bon placement entraîne un mouvement de la queue et un écoulement du LCR dans le réservoir de l’aiguille. Chez les rats juvéniles, cependant, aucune de ces lectures n’a pu être réalisée. Les auteurs ont ensuite tenté d’adapter une procédure sur une souris adulte à l’aide d’une seringue à insuline de 27 G insérée à un angle compris entre L5 et L610. Chez les souris adultes, qui sont généralement plus petites que les rats P28, cela ne produit pas de battement de queue, mais un mauvais placement de l’aiguille est évident par le reflux de l’injecté. Chez les rats juvéniles, cependant, cette approche a uniformément conduit à l’administration de l’injectat par voie épidurale, probablement en raison de l’élasticité différente entre les souris adultes et les rats juvéniles des couches tissulaires entourant la moelle épinière. Les approches par cathéter ont ensuite été évaluées. Plus précisément, un cathéter a été introduit par une incision dans la dure-mère de la citerne lombaire et jusqu’à la moelle épinière mi-thoracique ; Cependant, cette approche a entraîné un reflux important de l’injectat hors du site d’incision pendant l’accouchement. Les tentatives de placer le cathéter dans l’espace intrathécal par voie percutanée à l’aide d’une aiguille guide ont également été infructueuses. En raison de l’étroitesse de la largeur interlaminaire, le cathéter heurterait probablement la lame rostrale et ne progresserait pas.
Ici, une méthode est décrite pour obtenir une administration réussie et reproductible de la solution par ponction lombaire chez le rat juvénile. Cette approche peut être utilisée pour les vecteurs viraux, et probablement aussi pour les cellules, les produits pharmaceutiques et d’autres traitements.
Protocol
Representative Results
Discussion
Une grande variété de maladies affectent le SNC. Fournir une copie fonctionnelle du gène pertinent via un vecteur viral est une stratégie de traitement attrayante pour ceux qui sont récessifs et monogéniques par nature, comme l’amyotrophie spinale. Cependant, la barrière hémato-encéphalique (BHE) exclut la plupart des vecteurs de thérapie génique administrés par voie intraveineuse11. Ceux qui peuvent traverser la BHE, comme l’AAV9, doivent être administrés à fortes doses pour su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Steven Gray, Matthew Rioux, Nanda Regmi et Lacey Stearman de UT Southwestern pour une discussion productive sur le défi posé par les rats juvéniles pour l’injection intrathécale. Ce travail a été en partie soutenu par un financement de Jaguar Gene Therapy (à JLFK).
Materials
| 200 µL filtered pipette tips | MidSci | PR-200RK-FL | Pipetting virus |
| AAV9-GFP | Vector Builder | P200624-1005ynr | AAV9 vector expressing GFP |
| Absorbable Suture with Needle Coated Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Size 4 – 0 Braided | McKesson | J422H | Suture |
| Bench pad | VWR | 56616-031 | Surgery |
| Braintree Scientific Isothermal Pads, 8'' x 8'' | Fisher Scientific | 50-195-4664 | Maintains body temperature |
| Buprenorphine | McKesson | 1013922 | Analgesic |
| Buprenorphine-ER (1 mg/mL) | Zoopharma | Extended-release analgesic | |
| Cotton swabs | Fisher Scientific | 19-365-409 | Blood removal |
| Drape, Mouse, Clear Plastic, 12" x 12", with Adhesive Fenestration | Steris | 1212CPSTF | Surgical drape |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Forceps |
| Electric Blanket | CVS Health | CVS Health Series 500 Extra Long Heating Pad | |
| Eppendorf Research plus, 1-channel pipette, variable, 20–200 µL | Eppendorf | 3123000055 | Pipetting virus |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | Curved surgical scissors |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | 16121-14 | Laminectomy |
| Halsey Needle Holders | Fine Science Tools | 12001-13 | Needle driver |
| Insulin Syringes with Ultra-Fine Needle 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc | BD | 328431 | Syringe |
| Isoflurane | McKesson | 803250 | Anesthetic |
| Isopropanol wipes | Fisher Scientific | 22-031-350 | Skin disinfection |
| Lidocaine, 1% | McKesson | 239935 | Local anesthesia |
| Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-137 | Loading the syringe |
| Povidone-iodine | Fisher Scientific | 50-118-0481 | Skin disinfection |
| Scalpel Handle – #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Scalpel blade holder |
| Sure-Seal Induction Chamber | Braintree Scientific | EZ-17 | Anesthesia box |
| Surgical Blade Miltex Carbon Steel No. 11 Sterile Disposable Individually Wrapped | McKesson | 4-111 | #11 Scalpel blade |
| SYSTANE NIGHTTIME Eye Ointment | Alcon | Eye ointment | |
| Trypan Blue | VWR | 97063-702 | Injection |
References
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