משלוח וקטורי תוך-תאי בחולדות צעירות באמצעות הזרקת בור מים מותני
Summary
מתואר הליך כירורגי לביצוע זריקות לתוך בור המים המותני של החולדה הצעירה. גישה זו שימשה להעברה תוך-תאית של וקטורים של ריפוי גנטי, אך צפוי כי גישה זו תוכל לשמש למגוון טיפולים, כולל תאים ותרופות.
Abstract
ריפוי גנטי הוא טכנולוגיה רבת עוצמה כדי לספק גנים חדשים לחולה לטיפול במחלה, בין אם זה להחדיר גן פונקציונלי, להשבית גן רעיל, או לספק גן שהתוצר שלו יכול לווסת את הביולוגיה של המחלה. שיטת המסירה של הווקטור הטיפולי יכולה ללבוש צורות רבות, החל מעירוי תוך ורידי למסירה מערכתית ועד הזרקה ישירה לרקמת המטרה. עבור הפרעות נוירודגנרטיביות, לעתים קרובות רצוי להטות את הטרנסדוקציה לכיוון המוח ו / או חוט השדרה. הגישה הכי פחות פולשנית למיקוד מערכת העצבים המרכזית כולה כוללת הזרקה לנוזל השדרה (CSF), מה שמאפשר לטיפול להגיע לחלק גדול ממערכת העצבים המרכזית. הגישה הבטוחה ביותר להעברת וקטור לתוך CSF היא הזרקה intrathecal מותני, שבו מחט מוחדרת לתוך בור מותני של חוט השדרה. טכניקה זו, הידועה גם בשם ניקור מותני, נמצאת בשימוש נרחב במכרסמים יילודים ובוגרים ובמודלים של בעלי חיים גדולים. בעוד שהטכניקה דומה בין מינים ושלבי התפתחות, הבדלים עדינים בגודל, במבנה ובגמישות של רקמות המקיפות את החלל התוך-תאי דורשים התאמות בגישה. מאמר זה מתאר שיטה לביצוע ניקור מותני בחולדות צעירות כדי לספק וקטור סרוטיפ 9 הקשור לאדנו. כאן, 25-35 μL של וקטור הוזרקו לתוך הבור המותני, וכתב חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) שימש כדי להעריך את פרופיל ההתמרה כתוצאה מכל זריקה. היתרונות והאתגרים של גישה זו נדונים.
Introduction
ההבטחה של טיפולים גנטיים בתיווך ויראלי סוף סוף התגשמה בשנים האחרונות עם אישור ה- FDA לטיפולים לאטרופיה של שרירי עמוד השדרה, ניוון רשתית, המופיליה פקטור IX, סרטן ועוד 1,2,3,4. אינספור טיפולים אחרים נמצאים כעת בפיתוח. ריפוי גנטי נועד להעביר גן טיפולי לתאי המטופל. תוצרי הגן החדש יכולים להחליף את הפעילות החסרה בגן אנדוגני לקוי, לעכב גן רעיל, להרוג תאים סרטניים או לספק תפקוד מועיל אחר.
עבור מחלות המשפיעות על מערכת העצבים המרכזית (CNS), העברת וקטור הטיפול הגנטי ישירות לרקמת המטרה היא לעתים קרובות רצויה. גישות לא מערכתיות מספקות שני יתרונות: הן ממזערות תופעות לוואי מחוץ למטרה שעלולות להיגרם על ידי התמרה היקפית, והן מפחיתות מאוד את כמות הווקטור הדרושה להשגת רמות נאותות של התמרה ברקמת המטרה5.
ישנן מגוון גישות להעברת וקטורים של ריפוי גנטי למערכת העצבים המרכזית. הזרקה Intraparenchymal, הזרקה של וקטור ישירות לתוך חוט השדרה או רקמת המוח, יכול לשמש למסירה לאזור מוגדר. עם זאת, עבור מחלות רבות, transduction רחב של CNS רצוי. ניתן להשיג זאת על ידי העברת וקטור לנוזל השדרה (CSF)5, הנוזל שזורם בתוך ומסביב למוח ולחוט השדרה. ישנן שלוש דרכים עיקריות להעביר וקטורים ל- CSF. הגישה הפולשנית ביותר היא העברה תוך-מוחית, הכוללת קידוח חור בור דרך הגולגולת והתקדמות מחט דרך המוח לתוך החדרים הרוחביים. זה מניב התמרה בכל המוח. עם זאת, ההליך עלול לגרום לדימום תוך גולגולתי, והגישה בדרך כלל מייצרת רק התמרה מוגבלת של חוט השדרה6. הזרקה לתוך cisterna magna בבסיס הגולגולת היא פחות פולשנית, אבל נושאת את הסיכון של נזק לגזע המוח. בעוד שלעתים קרובות נעשה שימוש במחקר בבעלי חיים5, הזרקה לתוך cisterna magna כבר לא בשימוש שגרתי במרפאה7. ניקור מותני הוא הגישה הכי פחות פולשנית לגישה ל- CSF. זה כרוך בהחדרת מחט בין שתי חוליות מותניות לתוך בור המותני.
ניקור מותני למסירה וקטורית מבוצע באופן שגרתי בחולדות ועכברים בוגרים ובעכברים ילודים 8,9. מחברי מחקר זה ביצעו לאחרונה ניקורים מותניים בחולדות צעירות (גיל 28-30 יום) כדי לספק וקטורים של סרוטיפ 9 הקשור לנגיף אדנו (AAV9). בחולדות בוגרות, מחט ניקוב מותני בילוד הונחה במאונך בין חוליות L3 ו-L49. מיקום נכון גורם לתנועת זנב ו-CSF לזרום למעלה לתוך מאגר המחטים. בחולדות צעירות, לעומת זאת, לא ניתן היה להשיג אף אחת מהקריאות הללו. לאחר מכן ניסו החוקרים להתאים הליך עכברי בוגר באמצעות מזרק אינסולין 27 גרם שהוחדר בזווית בין L5 ל-L610. בעכברים בוגרים, שהם בדרך כלל קטנים יותר מחולדות P28, זה לא מייצר תנועת זנב, אבל מיקום מחט שגוי ניכר על ידי זרימה חוזרת של ההזרקה. בחולדות צעירות, לעומת זאת, גישה זו הובילה באופן אחיד להעברת ההזרקה באופן אפידורלי, ככל הנראה כתוצאה מגמישות שונה בין עכברים בוגרים לחולדות צעירות של שכבות הרקמה המקיפות את חוט השדרה. גישות הצנתר נבדקו בהמשך. באופן ספציפי, קטטר הוכנס דרך חתך בדורה של בור המים המותני ועד חוט השדרה באמצע בית החזה; עם זאת, גישה זו הובילה לרפלוקס משמעותי של ההזרקה חזרה ממקום החתך במהלך הלידה. גם ניסיונות להחדיר את הצנתר לחלל התוך-תאי באופן מלעורי באמצעות מחט מנחה לא צלחו. בשל הצרה של הרוחב הבין-למינרי, סביר להניח שהקטטר יפגע בלמינה הרוסטרלית ולא יתקדם.
כאן, מתוארת שיטה להשגת אספקת פתרון מוצלחת וניתנת לשחזור באמצעות ניקור מותני בחולדה הצעירה. גישה זו יכולה לשמש עבור וקטורים נגיפיים, וככל הנראה גם עבור תאים, תרופות וטיפולים אחרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
מגוון רחב של מחלות משפיעות על מערכת העצבים המרכזית. מתן עותק פונקציונלי של הגן הרלוונטי באמצעות וקטור נגיפי היא אסטרטגיית טיפול אטרקטיבית עבור אלה שהם רצסיביים ומונוגניים בטבע, כגון ניוון שרירים בעמוד השדרה. עם זאת, מחסום הדם-מוח (BBB) אינו כולל את רוב וקטורי הריפוי הגנטי הניתנים תוך ורידי<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות לסטיבן גריי, מתיו ריו, ננדה רגמי ולייסי סטרמן מ-UT Southwestern על דיון פורה באתגר שמציבות חולדות צעירות להזרקה תוך-תאית. עבודה זו נתמכה חלקית על ידי מימון של יגואר תרפיה גנטית (ל JLFK).
Materials
| 200 µL filtered pipette tips | MidSci | PR-200RK-FL | Pipetting virus |
| AAV9-GFP | Vector Builder | P200624-1005ynr | AAV9 vector expressing GFP |
| Absorbable Suture with Needle Coated Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Size 4 – 0 Braided | McKesson | J422H | Suture |
| Bench pad | VWR | 56616-031 | Surgery |
| Braintree Scientific Isothermal Pads, 8'' x 8'' | Fisher Scientific | 50-195-4664 | Maintains body temperature |
| Buprenorphine | McKesson | 1013922 | Analgesic |
| Buprenorphine-ER (1 mg/mL) | Zoopharma | Extended-release analgesic | |
| Cotton swabs | Fisher Scientific | 19-365-409 | Blood removal |
| Drape, Mouse, Clear Plastic, 12" x 12", with Adhesive Fenestration | Steris | 1212CPSTF | Surgical drape |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Forceps |
| Electric Blanket | CVS Health | CVS Health Series 500 Extra Long Heating Pad | |
| Eppendorf Research plus, 1-channel pipette, variable, 20–200 µL | Eppendorf | 3123000055 | Pipetting virus |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | Curved surgical scissors |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | 16121-14 | Laminectomy |
| Halsey Needle Holders | Fine Science Tools | 12001-13 | Needle driver |
| Insulin Syringes with Ultra-Fine Needle 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc | BD | 328431 | Syringe |
| Isoflurane | McKesson | 803250 | Anesthetic |
| Isopropanol wipes | Fisher Scientific | 22-031-350 | Skin disinfection |
| Lidocaine, 1% | McKesson | 239935 | Local anesthesia |
| Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-137 | Loading the syringe |
| Povidone-iodine | Fisher Scientific | 50-118-0481 | Skin disinfection |
| Scalpel Handle – #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Scalpel blade holder |
| Sure-Seal Induction Chamber | Braintree Scientific | EZ-17 | Anesthesia box |
| Surgical Blade Miltex Carbon Steel No. 11 Sterile Disposable Individually Wrapped | McKesson | 4-111 | #11 Scalpel blade |
| SYSTANE NIGHTTIME Eye Ointment | Alcon | Eye ointment | |
| Trypan Blue | VWR | 97063-702 | Injection |
References
- Wurster, C., Petri, S. Progress in spinal muscular atrophy research. Curr Opin Neurol. 35 (5), 693-698 (2022).
- Wu, K. Y., et al. Retinitis pigmentosa: Novel therapeutic targets and drug development. Pharmaceutics. 15 (2), 685 (2023).
- Larkin, H. First FDA-approved gene therapy for hemophilia. JAMA. 329 (1), 14 (2023).
- Lee, A. Nadofaragene firadenovec: First approval. Drugs. 83 (4), 353-357 (2023).
- Taghian, T., et al. A safe and reliable technique for CNS delivery of AAV vectors in the cisterna magna. Mol Ther. 28 (2), 411-421 (2020).
- Donsante, A., et al. Intracerebroventricular delivery of self-complementary adeno-associated virus serotype 9 to the adult rat brain. Gene Ther. 23 (5), 401-407 (2016).
- Pellot, J. E., Jesus, O. D. Suboccipital puncture. [Updated 2022 Jul 25]. StatPearls [Internet]. , (2022).
- Elliger, S. S., Elliger, C. A., Aguilar, C. P., Raju, N. R., Watson, G. L. Elimination of lysosomal storage in brains of MPS vii mice treated by intrathecal administration of an adeno-associated virus vector. Gene Ther. 6 (6), 1175-1178 (1999).
- De La Calle, J. L., Paino, C. L. A procedure for direct lumbar puncture in rats. Brain Res Bull. 59 (3), 245-250 (2002).
- O’connor, D. M., Lutomski, C., Jarrold, M. F., Boulis, N. M., Donsante, A. Lot-to-lot variation in adeno-associated virus serotype 9 (AAV9) preparations. Hum Gene Ther Methods. 30 (6), 214-225 (2019).
- Manfredsson, F. P., Rising, A. C., Mandel, R. J. AAV9: A potential blood-brain barrier buster. Mol Ther. 17 (3), 403-405 (2009).
- Hudry, E., Vandenberghe, L. H. Therapeutic AAV gene transfer to the nervous system: A clinical reality. Neuron. 101 (5), 839-862 (2019).
- Georg-Fries, B., Biederlack, S., Wolf, J., Zur Hausen, H. Analysis of proteins, helper dependence, and seroepidemiology of a new human parvovirus. Virology. 134 (1), 64-71 (1984).
- Schulz, M., et al. Binding and neutralizing anti-aav antibodies: Detection and implications for rAAV-mediated gene therapy. Mol Ther. 31 (3), 616-630 (2023).
- Gray, S. J., Nagabhushan Kalburgi, S., Mccown, T. J., Samulski, J. R. Global CNS gene delivery and evasion of anti-aav-neutralizing antibodies by intrathecal aav administration in non-human primates. Gene Ther. 20 (4), 450-459 (2013).
- Meyer, K., et al. Improving single injection CSF delivery of AAV9-mediated gene therapy for sma: A dose-response study in mice and non-human primates. Mol Ther. 23 (3), 477-487 (2015).
- Hinderer, C., et al. Evaluation of intrathecal routes of administration for adeno-associated viral vectors in large animals. Hum Gene Ther. 29 (1), 15-24 (2018).
- Wang, Y. F., et al. Cerebrospinal fluid leakage and headache after lumbar puncture: A prospective non-invasive imaging study. Brain. 138, 1492-1498 (2015).
- Hordeaux, J., et al. Adeno-associated virus-induced dorsal root ganglion pathology). Hum Gene Ther. 31 (15-16), 808-818 (2020).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 106-107, 1-16 (2013).
- Fang, H., et al. Comparison of adeno-associated virus serotypes and delivery methods for cardiac gene transfer. Hum Gene Ther Methods. 23 (4), 234-241 (2012).
.