काठ का कुंड इंजेक्शन के माध्यम से किशोर चूहों में इंट्राथेकल वेक्टर डिलीवरी
Summary
किशोर चूहे के काठ का कुंड में इंजेक्शन करने के लिए एक शल्य चिकित्सा प्रक्रिया का वर्णन किया गया है। इस दृष्टिकोण का उपयोग जीन थेरेपी वैक्टर के इंट्राथेकल वितरण के लिए किया गया है, लेकिन यह अनुमान लगाया गया है कि इस दृष्टिकोण का उपयोग कोशिकाओं और दवाओं सहित विभिन्न प्रकार के चिकित्सीय के लिए किया जा सकता है।
Abstract
जीन थेरेपी बीमारी के इलाज के लिए एक मरीज को नए जीन देने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है, चाहे वह एक कार्यात्मक जीन पेश करना हो, एक विषाक्त जीन को निष्क्रिय करना हो, या एक जीन प्रदान करना हो जिसका उत्पाद रोग के जीव विज्ञान को संशोधित कर सके। चिकित्सीय वेक्टर के लिए वितरण विधि कई रूप ले सकती है, प्रणालीगत वितरण के लिए अंतःशिरा जलसेक से लेकर लक्ष्य ऊतक में सीधे इंजेक्शन तक। न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों के लिए, अक्सर मस्तिष्क और/या रीढ़ की हड्डी की ओर पारगमन को तिरछा करना वांछनीय होता है। पूरे केंद्रीय तंत्रिका तंत्र को लक्षित करने के लिए कम से कम आक्रामक दृष्टिकोण में मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) में इंजेक्शन शामिल है, जिससे चिकित्सीय केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के एक बड़े अंश तक पहुंच सकता है। सीएसएफ में एक वेक्टर देने का सबसे सुरक्षित तरीका काठ का इंट्राथेकल इंजेक्शन है, जहां रीढ़ की हड्डी के काठ का कुंड में एक सुई पेश की जाती है। यह तकनीक, जिसे काठ का पंचर के रूप में भी जाना जाता है, का व्यापक रूप से नवजात और वयस्क कृन्तकों और बड़े पशु मॉडल में उपयोग किया जाता है। जबकि तकनीक प्रजातियों और विकास के चरणों में समान है, इंट्राथेकल स्पेस के आसपास के ऊतकों के आकार, संरचना और लोच में सूक्ष्म अंतर के लिए दृष्टिकोण में आवास की आवश्यकता होती है। यह आलेख एक एडेनो-जुड़े सीरोटाइप 9 वेक्टर देने के लिए किशोर चूहों में काठ का पंचर करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। यहां, वेक्टर के 25-35 माइक्रोन को काठ का कुंड में इंजेक्ट किया गया था, और प्रत्येक इंजेक्शन से उत्पन्न पारगमन प्रोफ़ाइल का मूल्यांकन करने के लिए एक हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) रिपोर्टर का उपयोग किया गया था। इस दृष्टिकोण के लाभों और चुनौतियों पर चर्चा की जाती है।
Introduction
वायरल मध्यस्थता जीन चिकित्सा का वादा अंत में रीढ़ की हड्डी पेशी शोष के लिए उपचार की एफडीए अनुमोदन के साथ हाल के वर्षों में एहसास हुआ है, रेटिना डिस्ट्रोफी, कारक IX हीमोफिलिया, कैंसर, और अधिक 1,2,3,4. अनगिनत अन्य चिकित्सीय वर्तमान में विकास में हैं। जीन थेरेपी का उद्देश्य रोगी की कोशिकाओं को चिकित्सीय जीन देना है। इस नए जीन के उत्पाद एक कमी अंतर्जात जीन से लापता गतिविधि को प्रतिस्थापित कर सकते हैं, एक विषाक्त जीन को रोक सकते हैं, कैंसर कोशिकाओं को मार सकते हैं, या कुछ अन्य लाभकारी कार्य प्रदान कर सकते हैं।
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) को प्रभावित करने वाली बीमारियों के लिए, जीन थेरेपी वेक्टर को सीधे लक्ष्य ऊतक तक पहुंचाना अक्सर वांछनीय होता है। गैर-प्रणालीगत दृष्टिकोण दो लाभ प्रदान करते हैं: वे परिधीय पारगमन के कारण होने वाले ऑफ-टारगेट साइड इफेक्ट्स को कम करते हैं, और वे लक्ष्य ऊतक 5 में पारगमन के पर्याप्त स्तर को प्राप्त करने के लिए आवश्यक वेक्टर की मात्रा को बहुत कम करतेहैं।
सीएनएस को जीन थेरेपी वैक्टर देने के लिए कई तरह के दृष्टिकोण हैं। इंट्रापैरेन्काइमल इंजेक्शन, रीढ़ की हड्डी या मस्तिष्क के ऊतकों में सीधे एक वेक्टर का इंजेक्शन, एक परिभाषित क्षेत्र में डिलीवरी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, कई बीमारियों के लिए, सीएनएस का व्यापक पारगमन वांछित है। यह मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ)5को एक वेक्टर देकर पूरा किया जा सकता है, तरल पदार्थ जो मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी में और उसके आसपास बहता है। सीएसएफ को वैक्टर देने के तीन प्राथमिक तरीके हैं। सबसे आक्रामक दृष्टिकोण इंट्रासेरेब्रोवेंट्रिकुलर डिलीवरी है, जिसमें खोपड़ी के माध्यम से एक गड़गड़ाहट छेद ड्रिलिंग और पार्श्व निलय में मस्तिष्क के माध्यम से एक सुई को आगे बढ़ाना शामिल है। यह पूरे मस्तिष्क में पारगमन पैदा करता है। हालांकि, प्रक्रिया इंट्राक्रैनील रक्तस्राव का कारण बन सकती है, और दृष्टिकोण आम तौर पर रीढ़ की हड्डी6 के केवल सीमित पारगमन का उत्पादन करता है। खोपड़ी के आधार पर सिस्टर्न मैग्ना में इंजेक्शन कम आक्रामक है, लेकिन ब्रेनस्टेम को नुकसान का जोखिम उठाता है। जबकि अक्सर पशु अनुसंधान5 में प्रयोग किया जाता है, कुंड मैग्ना में इंजेक्शन अब क्लिनिक7 में नियमित रूप से उपयोग नहीं किया जाता है। सीएसएफ तक पहुंचने के लिए काठ का पंचर सबसे कम आक्रामक दृष्टिकोण है। इसमें दो काठ कशेरुकाओं के बीच और काठ का कुंड में एक सुई रखना शामिल है।
वेक्टर प्रसव के लिए काठ का पंचर नियमित रूप से वयस्क चूहों और चूहों में और नवजात चूहों 8,9 में किया जाता है. इस अध्ययन के लेखकों ने हाल ही में एडेनो-जुड़े वायरस सीरोटाइप 9 (एएवी 9) वैक्टर देने के लिए किशोर चूहों (28-30 दिन की उम्र) में काठ का पंचर किया। वयस्क चूहों में, एक नवजात काठ का पंचर सुई L3 और L4 कशेरुकाओं9 के बीच लंबवत रखा गया था. उचित प्लेसमेंट के परिणामस्वरूप एक टेल फ्लिक और सीएसएफ सुई जलाशय में बहता है। किशोर चूहों में, हालांकि, इनमें से कोई भी रीड-आउट हासिल नहीं किया जा सका। लेखकों तो एक 27 जी इंसुलिन सिरिंज एल 5 और एल 610 के बीच एक कोण पर डाला का उपयोग कर एक वयस्क माउस प्रक्रिया को अनुकूलित करने का प्रयास किया. वयस्क चूहों में, जो आम तौर पर P28 चूहों से छोटे होते हैं, यह एक पूंछ झटका का उत्पादन नहीं करता है, लेकिन गलत सुई प्लेसमेंट इंजेक्शन के बैकफ्लो से स्पष्ट है। किशोर चूहों में, हालांकि, इस दृष्टिकोण ने समान रूप से इंजेक्शन को एपिड्यूरल रूप से वितरित किया जा रहा है, संभवतः वयस्क चूहों और रीढ़ की हड्डी के आसपास ऊतक परतों के किशोर चूहों के बीच अलग-अलग लोच के परिणामस्वरूप होता है। कैथेटर दृष्टिकोण अगले मूल्यांकन किया गया. विशेष रूप से, एक कैथेटर काठ का कुंड के ड्यूरा में और मध्य वक्ष रीढ़ की हड्डी तक एक चीरा के माध्यम से पेश किया गया था; हालांकि, इस दृष्टिकोण प्रसव के दौरान चीरा साइट से वापस इंजेक्शन के पर्याप्त भाटा के लिए नेतृत्व. एक गाइड सुई का उपयोग करके कैथेटर को इंट्राथेकल स्पेस में रखने के प्रयास भी असफल रहे। इंटरलामिनार चौड़ाई की संकीर्णता के कारण, कैथेटर संभवतः रोस्ट्रल लैमिना से टकराएगा और आगे बढ़ने में विफल रहेगा।
यहां, किशोर चूहे में एक काठ का पंचर के माध्यम से सफल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य समाधान वितरण प्राप्त करने के लिए एक विधि का वर्णन किया गया है। इस दृष्टिकोण का उपयोग वायरल वैक्टर के लिए किया जा सकता है, और संभवतः कोशिकाओं, फार्मास्यूटिकल्स और अन्य चिकित्सीय के लिए भी।
Protocol
Representative Results
Discussion
विभिन्न प्रकार के रोग सीएनएस को प्रभावित करते हैं। वायरल वेक्टर के माध्यम से प्रासंगिक जीन की एक कार्यात्मक प्रतिलिपि प्रदान करना उन लोगों के लिए एक आकर्षक उपचार रणनीति है जो प्रकृति में पुनरावर्ती ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक इंट्राथेकल इंजेक्शन के लिए किशोर चूहों द्वारा उत्पन्न चुनौती की उत्पादक चर्चा के लिए यूटी साउथवेस्टर्न के स्टीवन ग्रे, मैथ्यू रिओक्स, नंदा रेग्मी और लेसी स्टीयरमैन का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं। इस काम को आंशिक रूप से जगुआर जीन थेरेपी (जेएलएफके को) से वित्त पोषण द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 200 µL filtered pipette tips | MidSci | PR-200RK-FL | Pipetting virus |
| AAV9-GFP | Vector Builder | P200624-1005ynr | AAV9 vector expressing GFP |
| Absorbable Suture with Needle Coated Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Size 4 – 0 Braided | McKesson | J422H | Suture |
| Bench pad | VWR | 56616-031 | Surgery |
| Braintree Scientific Isothermal Pads, 8'' x 8'' | Fisher Scientific | 50-195-4664 | Maintains body temperature |
| Buprenorphine | McKesson | 1013922 | Analgesic |
| Buprenorphine-ER (1 mg/mL) | Zoopharma | Extended-release analgesic | |
| Cotton swabs | Fisher Scientific | 19-365-409 | Blood removal |
| Drape, Mouse, Clear Plastic, 12" x 12", with Adhesive Fenestration | Steris | 1212CPSTF | Surgical drape |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Forceps |
| Electric Blanket | CVS Health | CVS Health Series 500 Extra Long Heating Pad | |
| Eppendorf Research plus, 1-channel pipette, variable, 20–200 µL | Eppendorf | 3123000055 | Pipetting virus |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | Curved surgical scissors |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | 16121-14 | Laminectomy |
| Halsey Needle Holders | Fine Science Tools | 12001-13 | Needle driver |
| Insulin Syringes with Ultra-Fine Needle 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc | BD | 328431 | Syringe |
| Isoflurane | McKesson | 803250 | Anesthetic |
| Isopropanol wipes | Fisher Scientific | 22-031-350 | Skin disinfection |
| Lidocaine, 1% | McKesson | 239935 | Local anesthesia |
| Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-137 | Loading the syringe |
| Povidone-iodine | Fisher Scientific | 50-118-0481 | Skin disinfection |
| Scalpel Handle – #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Scalpel blade holder |
| Sure-Seal Induction Chamber | Braintree Scientific | EZ-17 | Anesthesia box |
| Surgical Blade Miltex Carbon Steel No. 11 Sterile Disposable Individually Wrapped | McKesson | 4-111 | #11 Scalpel blade |
| SYSTANE NIGHTTIME Eye Ointment | Alcon | Eye ointment | |
| Trypan Blue | VWR | 97063-702 | Injection |
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