Somministrazione intratecale di vettori in ratti giovani tramite iniezione nella cisterna lombare
Summary
Viene descritta una procedura chirurgica per eseguire iniezioni nella cisterna lombare del ratto giovane. Questo approccio è stato utilizzato per la somministrazione intratecale di vettori di terapia genica, ma si prevede che questo approccio possa essere utilizzato per una varietà di terapie, tra cui cellule e farmaci.
Abstract
La terapia genica è una potente tecnologia per fornire nuovi geni a un paziente per il trattamento della malattia, sia per introdurre un gene funzionale, inattivare un gene tossico o fornire un gene il cui prodotto può modulare la biologia della malattia. Il metodo di somministrazione del vettore terapeutico può assumere molte forme, che vanno dall’infusione endovenosa per la somministrazione sistemica all’iniezione diretta nel tessuto bersaglio. Per le malattie neurodegenerative, è spesso auspicabile inclinare la trasduzione verso il cervello e/o il midollo spinale. L’approccio meno invasivo per colpire l’intero sistema nervoso centrale prevede l’iniezione nel liquido cerebrospinale (CSF), consentendo alla terapia di raggiungere un’ampia frazione del sistema nervoso centrale. L’approccio più sicuro per rilasciare un vettore nel liquido cerebrospinale è l’iniezione intratecale lombare, in cui un ago viene introdotto nella cisterna lombare del midollo spinale. Questa tecnica, nota anche come puntura lombare, è stata ampiamente utilizzata nei roditori neonatali e adulti e nei modelli animali di grandi dimensioni. Sebbene la tecnica sia simile tra le specie e gli stadi di sviluppo, sottili differenze nelle dimensioni, nella struttura e nell’elasticità dei tessuti che circondano lo spazio intratecale richiedono sistemazioni nell’approccio. Questo articolo descrive un metodo per eseguire la puntura lombare nei ratti giovani per fornire un vettore del sierotipo 9 adeno-associato. Qui, 25-35 μL di vettore sono stati iniettati nella cisterna lombare e un reporter di proteina fluorescente verde (GFP) è stato utilizzato per valutare il profilo di trasduzione risultante da ciascuna iniezione. Vengono discussi i vantaggi e le sfide di questo approccio.
Introduction
La promessa delle terapie geniche mediate da virus è stata finalmente realizzata negli ultimi anni con l’approvazione da parte della FDA di trattamenti per l’atrofia muscolare spinale, la distrofia retinica, l’emofilia del fattore IX, il cancro e altro ancora. Innumerevoli altre terapie sono attualmente in fase di sviluppo. La terapia genica mira a fornire un gene terapeutico alle cellule di un paziente. I prodotti di questo nuovo gene possono sostituire l’attività mancante di un gene endogeno carente, inibire un gene tossico, uccidere le cellule cancerose o fornire qualche altra funzione benefica.
Per le malattie che colpiscono il sistema nervoso centrale (SNC), è spesso auspicabile somministrare il vettore della terapia genica direttamente al tessuto bersaglio. Gli approcci non sistemici offrono due vantaggi: riducono al minimo gli effetti collaterali fuori bersaglio che possono essere causati dalla trasduzione periferica e riducono notevolmente la quantità di vettore necessaria per raggiungere livelli adeguati di trasduzione nel tessuto bersaglio5.
Esistono diversi approcci per fornire vettori di terapia genica al SNC. L’iniezione intraparenchimale, l’iniezione di un vettore direttamente nel midollo spinale o nel tessuto cerebrale, può essere utilizzata per la consegna in una regione definita. Tuttavia, per molte malattie, è auspicabile un’ampia trasduzione del SNC. Ciò può essere ottenuto fornendo un vettore al liquido cerebrospinale (CSF)5, il fluido che scorre dentro e intorno al cervello e al midollo spinale. Esistono tre modi principali per fornire vettori al CSF. L’approccio più invasivo è la somministrazione intracerebroventricolare, che prevede la perforazione di un foro attraverso il cranio e l’avanzamento di un ago attraverso il cervello nei ventricoli laterali. Questo produce la trasduzione in tutto il cervello. Tuttavia, la procedura può causare emorragia intracranica e l’approccio generalmente produce solo una trasduzione limitata del midollo spinale6. L’iniezione nella cisterna magna alla base del cranio è meno invasiva, ma comporta il rischio di danni al tronco encefalico. Sebbene sia spesso utilizzata nella ricerca sugli animali5, l’iniezione nella cisterna magna non viene più utilizzata di routine in clinica7. La puntura lombare è l’approccio meno invasivo per accedere al liquido cerebrospinale. Ciò comporta il posizionamento di un ago tra due vertebre lombari e nella cassetta lombare.
La puntura lombare per la somministrazione del vettore viene eseguita di routine nei ratti e nei topi adulti e nei topi neonatali 8,9. Gli autori di questo studio hanno recentemente eseguito punture lombari in ratti giovani (28-30 giorni di età) per fornire vettori del sierotipo 9 del virus adeno-associato (AAV9). Nei ratti adulti, un ago per puntura lombare neonatale è stato posizionato verticalmente tra le vertebre L3 e L49. Il corretto posizionamento provoca un movimento della coda e un liquido cerebrospinale che scorre nel serbatoio dell’ago. Nei ratti giovani, tuttavia, non è stato possibile ottenere nessuna di queste letture. Gli autori hanno quindi tentato di adattare una procedura su un topo adulto utilizzando una siringa da insulina da 27 G inserita con un angolo compreso tra L5 e L610. Nei topi adulti, che sono in genere più piccoli dei ratti P28, questo non produce un movimento della coda, ma il posizionamento errato dell’ago è evidente dal riflusso dell’iniettato. Nei ratti giovani, tuttavia, questo approccio ha portato uniformemente alla somministrazione dell’iniettato per via epidurale, probabilmente a causa della diversa elasticità tra i topi adulti e i ratti giovani degli strati di tessuto che circondano il midollo spinale. Successivamente sono stati valutati gli approcci al catetere. Nello specifico, un catetere è stato introdotto attraverso un’incisione nella dura della cisterna lombare e fino al midollo spinale medio-toracico; Tuttavia, questo approccio ha portato a un sostanziale reflusso dell’iniettato fuori dal sito di incisione durante il parto. Anche i tentativi di posizionare il catetere nello spazio intratecale per via percutanea utilizzando un ago guida non hanno avuto successo. A causa della ristrettezza della larghezza interlaminare, il catetere probabilmente colpirebbe la lamina rostrale e non riuscirebbe ad avanzare.
Qui, viene descritto un metodo per ottenere una somministrazione di soluzione efficace e riproducibile tramite una puntura lombare nel ratto giovane. Questo approccio può essere utilizzato per vettori virali e probabilmente anche per cellule, prodotti farmaceutici e altre terapie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un’ampia varietà di malattie colpisce il SNC. Fornire una copia funzionale del gene pertinente tramite un vettore virale è una strategia di trattamento interessante per coloro che sono di natura recessiva e monogenica, come l’atrofia muscolare spinale. Tuttavia, la barriera emato-encefalica (BEE) esclude la maggior parte dei vettori di terapia genica somministrati per via endovenosa11. Quelli che possono attraversare la BEE, come l’AAV9, devono essere somministrati in dosi elevate per superare l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Steven Gray, Matthew Rioux, Nanda Regmi e Lacey Stearman dell’UT Southwestern per una discussione produttiva sulla sfida posta dai ratti giovani per l’iniezione intratecale. Questo lavoro è stato in parte sostenuto da finanziamenti di Jaguar Gene Therapy (a JLFK).
Materials
| 200 µL filtered pipette tips | MidSci | PR-200RK-FL | Pipetting virus |
| AAV9-GFP | Vector Builder | P200624-1005ynr | AAV9 vector expressing GFP |
| Absorbable Suture with Needle Coated Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Size 4 – 0 Braided | McKesson | J422H | Suture |
| Bench pad | VWR | 56616-031 | Surgery |
| Braintree Scientific Isothermal Pads, 8'' x 8'' | Fisher Scientific | 50-195-4664 | Maintains body temperature |
| Buprenorphine | McKesson | 1013922 | Analgesic |
| Buprenorphine-ER (1 mg/mL) | Zoopharma | Extended-release analgesic | |
| Cotton swabs | Fisher Scientific | 19-365-409 | Blood removal |
| Drape, Mouse, Clear Plastic, 12" x 12", with Adhesive Fenestration | Steris | 1212CPSTF | Surgical drape |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Forceps |
| Electric Blanket | CVS Health | CVS Health Series 500 Extra Long Heating Pad | |
| Eppendorf Research plus, 1-channel pipette, variable, 20–200 µL | Eppendorf | 3123000055 | Pipetting virus |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | Curved surgical scissors |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | 16121-14 | Laminectomy |
| Halsey Needle Holders | Fine Science Tools | 12001-13 | Needle driver |
| Insulin Syringes with Ultra-Fine Needle 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc | BD | 328431 | Syringe |
| Isoflurane | McKesson | 803250 | Anesthetic |
| Isopropanol wipes | Fisher Scientific | 22-031-350 | Skin disinfection |
| Lidocaine, 1% | McKesson | 239935 | Local anesthesia |
| Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-137 | Loading the syringe |
| Povidone-iodine | Fisher Scientific | 50-118-0481 | Skin disinfection |
| Scalpel Handle – #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Scalpel blade holder |
| Sure-Seal Induction Chamber | Braintree Scientific | EZ-17 | Anesthesia box |
| Surgical Blade Miltex Carbon Steel No. 11 Sterile Disposable Individually Wrapped | McKesson | 4-111 | #11 Scalpel blade |
| SYSTANE NIGHTTIME Eye Ointment | Alcon | Eye ointment | |
| Trypan Blue | VWR | 97063-702 | Injection |
References
- Wurster, C., Petri, S. Progress in spinal muscular atrophy research. Curr Opin Neurol. 35 (5), 693-698 (2022).
- Wu, K. Y., et al. Retinitis pigmentosa: Novel therapeutic targets and drug development. Pharmaceutics. 15 (2), 685 (2023).
- Larkin, H. First FDA-approved gene therapy for hemophilia. JAMA. 329 (1), 14 (2023).
- Lee, A. Nadofaragene firadenovec: First approval. Drugs. 83 (4), 353-357 (2023).
- Taghian, T., et al. A safe and reliable technique for CNS delivery of AAV vectors in the cisterna magna. Mol Ther. 28 (2), 411-421 (2020).
- Donsante, A., et al. Intracerebroventricular delivery of self-complementary adeno-associated virus serotype 9 to the adult rat brain. Gene Ther. 23 (5), 401-407 (2016).
- Pellot, J. E., Jesus, O. D. Suboccipital puncture. [Updated 2022 Jul 25]. StatPearls [Internet]. , (2022).
- Elliger, S. S., Elliger, C. A., Aguilar, C. P., Raju, N. R., Watson, G. L. Elimination of lysosomal storage in brains of MPS vii mice treated by intrathecal administration of an adeno-associated virus vector. Gene Ther. 6 (6), 1175-1178 (1999).
- De La Calle, J. L., Paino, C. L. A procedure for direct lumbar puncture in rats. Brain Res Bull. 59 (3), 245-250 (2002).
- O’connor, D. M., Lutomski, C., Jarrold, M. F., Boulis, N. M., Donsante, A. Lot-to-lot variation in adeno-associated virus serotype 9 (AAV9) preparations. Hum Gene Ther Methods. 30 (6), 214-225 (2019).
- Manfredsson, F. P., Rising, A. C., Mandel, R. J. AAV9: A potential blood-brain barrier buster. Mol Ther. 17 (3), 403-405 (2009).
- Hudry, E., Vandenberghe, L. H. Therapeutic AAV gene transfer to the nervous system: A clinical reality. Neuron. 101 (5), 839-862 (2019).
- Georg-Fries, B., Biederlack, S., Wolf, J., Zur Hausen, H. Analysis of proteins, helper dependence, and seroepidemiology of a new human parvovirus. Virology. 134 (1), 64-71 (1984).
- Schulz, M., et al. Binding and neutralizing anti-aav antibodies: Detection and implications for rAAV-mediated gene therapy. Mol Ther. 31 (3), 616-630 (2023).
- Gray, S. J., Nagabhushan Kalburgi, S., Mccown, T. J., Samulski, J. R. Global CNS gene delivery and evasion of anti-aav-neutralizing antibodies by intrathecal aav administration in non-human primates. Gene Ther. 20 (4), 450-459 (2013).
- Meyer, K., et al. Improving single injection CSF delivery of AAV9-mediated gene therapy for sma: A dose-response study in mice and non-human primates. Mol Ther. 23 (3), 477-487 (2015).
- Hinderer, C., et al. Evaluation of intrathecal routes of administration for adeno-associated viral vectors in large animals. Hum Gene Ther. 29 (1), 15-24 (2018).
- Wang, Y. F., et al. Cerebrospinal fluid leakage and headache after lumbar puncture: A prospective non-invasive imaging study. Brain. 138, 1492-1498 (2015).
- Hordeaux, J., et al. Adeno-associated virus-induced dorsal root ganglion pathology). Hum Gene Ther. 31 (15-16), 808-818 (2020).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 106-107, 1-16 (2013).
- Fang, H., et al. Comparison of adeno-associated virus serotypes and delivery methods for cardiac gene transfer. Hum Gene Ther Methods. 23 (4), 234-241 (2012).
.