腰椎貯水槽注射による幼若ラットの髄腔内ベクター送達
Summary
幼若ラットの腰椎槽に注射を行うための外科的処置が記載されている。このアプローチは、遺伝子治療ベクターの髄腔内送達に使用されてきましたが、このアプローチは、細胞や薬物を含むさまざまな治療に使用できることが期待されています。
Abstract
遺伝子治療は、機能遺伝子の導入、毒性遺伝子の不活性化、または製品の疾患生物学を調節できる遺伝子の提供など、疾患の治療のために患者に新しい遺伝子を送達するための強力な技術です。治療用ベクターの送達方法は、全身送達のための静脈内注入から標的組織への直接注入まで、さまざまな形態をとることができます。神経変性疾患の場合、形質導入を脳や脊髄に偏らせることが望ましいことがよくあります。中枢神経系全体を標的とする最も侵襲性の低いアプローチには、脳脊髄液(CSF)への注射が含まれ、治療薬が中枢神経系の大部分に到達することを可能にします。CSFにベクターを送達する最も安全なアプローチは、針を脊髄の腰椎槽に導入する腰椎髄腔内注射です。この技術は、腰椎穿刺とも呼ばれ、新生児や成体のげっ歯類、および大型動物モデルで広く使用されています。この手法は種や発生段階によって似ていますが、髄腔内空間を取り巻く組織のサイズ、構造、弾力性の微妙な違いにより、アプローチには適応が必要です。この記事では、アデノ随伴血清型9ベクターを送達するために、幼若ラットに腰椎穿刺を行う方法について説明します。ここでは、25〜35μLのベクターを腰椎槽に注入し、緑色蛍光タンパク質(GFP)レポーターを使用して、各注入から生じる形質導入プロファイルを評価しました。このアプローチの利点と課題について説明します。
Introduction
近年、脊髄性筋萎縮症、網膜ジストロフィー、第IX因子血友病、がんなどの治療薬がFDAに承認されたことで、ウイルス媒介性遺伝子治療の有望性がついに実現されました1,2,3,4。現在、他にも数え切れないほどの治療法が開発されています。遺伝子治療は、治療用遺伝子を患者さんの細胞に届けることを目的としています。この新しい遺伝子の産物は、欠損した内因性遺伝子の欠落した活性を補ったり、毒性遺伝子を阻害したり、がん細胞を殺したり、その他の有益な機能を提供したりすることができます。
中枢神経系(CNS)に影響を与える疾患では、遺伝子治療ベクターを標的組織に直接送達することが望ましい場合が多いです。非全身的アプローチは、末梢形質導入によって引き起こされる可能性のあるオフターゲット副作用を最小限に抑えることと、標的組織5で適切なレベルの形質導入を達成するために必要なベクターの量を大幅に減少させるという2つの利点を提供する。
遺伝子治療ベクターをCNSに送達するには、さまざまなアプローチがあります。実質内注射は、ベクターを脊髄または脳組織に直接注入することであり、定義された領域への送達に使用できます。しかし、多くの疾患では、CNSの広範な形質導入が望まれています。これは、脳と脊髄の中や周囲を流れる脳脊髄液(CSF)5にベクターを送達することで達成できます。ベクトルを CSF に送達するには、主に 3 つの方法があります。最も侵襲的なアプローチは、頭蓋骨にバリ穴を開け、脳から側脳室に針を進める脳室内分娩です。これにより、脳全体に形質導入が起こります。しかし、この手順は頭蓋内出血を引き起こす可能性があり、このアプローチは一般に脊髄の限定的な形質導入のみを引き起こします6。頭蓋骨の基部にある大槽への注射は侵襲性が低いですが、脳幹に損傷を与えるリスクがあります。動物実験5ではよく使用されるが、大槽への注射はもはや診療所では日常的に使用されていない7。腰椎穿刺は、CSFにアクセスするための最も侵襲性の低いアプローチです。これには、2つの腰椎の間と腰椎槽に針を配置することが含まれます。
ベクター送達のための腰椎穿刺は、成体ラットとマウス、および新生児マウスで日常的に行われています8,9。この研究の著者らは最近、幼若ラット(生後28〜30日)で腰椎穿刺を行い、アデノ随伴ウイルス血清型9(AAV9)ベクターを送達しました。成体ラットでは、新生児腰椎穿刺針をL3椎骨とL4椎骨9の間に垂直に配置した。適切に配置すると、テールフリックとCSFがニードルリザーバーに流れ込みます。しかし、幼若ラットでは、これらの読み出しはどちらも達成できませんでした。次に、著者らは、L5とL6の間の角度で挿入された27Gインスリン注射器を使用して、成体マウスの手順を適応させようと試みました10。成体マウスでは、通常、P28ラットよりも小さいため、これはテールフリックを引き起こしませんが、注射液の逆流により誤った針の配置が明らかになります。しかし、幼若ラットでは、このアプローチにより、注射液が硬膜外に送達されることが一様に示され、これは、成体マウスと幼若ラットの間で脊髄を囲む組織層の弾力性が異なるためと考えられる。次に、カテーテルアプローチを評価しました。具体的には、カテーテルは腰椎槽の硬膜の切開部から胸部中央部の脊髄まで導入されました。しかし、このアプローチでは、分娩中に注射液が切開部位から大幅に逆流することになりました。ガイド針を使用して経皮的にカテーテルを髄腔内空間に配置する試みも成功しませんでした。層間幅が狭いため、カテーテルは吻側椎吻板に当たって前進しない可能性があります。
ここでは、幼若ラットにおける腰椎穿刺 による 成功し再現性のある溶液送達を達成するための方法が記載されている。このアプローチは、ウイルスベクターに使用でき、細胞、医薬品、その他の治療薬にも使用できる可能性があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
CNSにはさまざまな疾患が罹患しています。ウイルスベクターを介して関連遺伝子の機能的コピーを提供することは、脊髄性筋萎縮症など、本質的に劣性で単一遺伝子である患者にとって魅力的な治療戦略です。ただし、血液脳関門 (BBB) は、静脈内投与されるほとんどの遺伝子治療ベクターを除外します11。AAV9のようなBBBを通過できるものは、末梢形質導入によるベクター損…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、幼若ラットが髄腔内注射に対してもたらす課題について生産的な議論をしてくれたUTサウスウェスタン大学のSteven Gray氏、Matthew Rioux氏、Nanda Regmi氏、Lacey Stearman氏に感謝します。この研究は、ジャガー・ジーン・セラピー(JLFK)からの資金提供によって部分的に支援されました。
Materials
| 200 µL filtered pipette tips | MidSci | PR-200RK-FL | Pipetting virus |
| AAV9-GFP | Vector Builder | P200624-1005ynr | AAV9 vector expressing GFP |
| Absorbable Suture with Needle Coated Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Size 4 – 0 Braided | McKesson | J422H | Suture |
| Bench pad | VWR | 56616-031 | Surgery |
| Braintree Scientific Isothermal Pads, 8'' x 8'' | Fisher Scientific | 50-195-4664 | Maintains body temperature |
| Buprenorphine | McKesson | 1013922 | Analgesic |
| Buprenorphine-ER (1 mg/mL) | Zoopharma | Extended-release analgesic | |
| Cotton swabs | Fisher Scientific | 19-365-409 | Blood removal |
| Drape, Mouse, Clear Plastic, 12" x 12", with Adhesive Fenestration | Steris | 1212CPSTF | Surgical drape |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Forceps |
| Electric Blanket | CVS Health | CVS Health Series 500 Extra Long Heating Pad | |
| Eppendorf Research plus, 1-channel pipette, variable, 20–200 µL | Eppendorf | 3123000055 | Pipetting virus |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | Curved surgical scissors |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | 16121-14 | Laminectomy |
| Halsey Needle Holders | Fine Science Tools | 12001-13 | Needle driver |
| Insulin Syringes with Ultra-Fine Needle 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc | BD | 328431 | Syringe |
| Isoflurane | McKesson | 803250 | Anesthetic |
| Isopropanol wipes | Fisher Scientific | 22-031-350 | Skin disinfection |
| Lidocaine, 1% | McKesson | 239935 | Local anesthesia |
| Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-137 | Loading the syringe |
| Povidone-iodine | Fisher Scientific | 50-118-0481 | Skin disinfection |
| Scalpel Handle – #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Scalpel blade holder |
| Sure-Seal Induction Chamber | Braintree Scientific | EZ-17 | Anesthesia box |
| Surgical Blade Miltex Carbon Steel No. 11 Sterile Disposable Individually Wrapped | McKesson | 4-111 | #11 Scalpel blade |
| SYSTANE NIGHTTIME Eye Ointment | Alcon | Eye ointment | |
| Trypan Blue | VWR | 97063-702 | Injection |
References
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