Intratekal vektorlevering hos unge rotter via lumbal cisterninjeksjon
Summary
En kirurgisk prosedyre er beskrevet for å utføre injeksjoner i lumbalsisternen til den unge rotten. Denne tilnærmingen har blitt brukt til intratekal levering av genterapivektorer, men det forventes at denne tilnærmingen kan brukes til en rekke terapier, inkludert celler og legemidler.
Abstract
Genterapi er en kraftig teknologi for å levere nye gener til en pasient for behandling av sykdom, det være seg å introdusere et funksjonelt gen, inaktivere et giftig gen eller gi et gen hvis produkt kan modulere sykdommens biologi. Leveringsmetoden for den terapeutiske vektoren kan ha mange former, alt fra intravenøs infusjon for systemisk levering til direkte injeksjon i målvevet. Ved nevrodegenerative lidelser er det ofte ønskelig å skjeve transduksjon mot hjernen og/eller ryggmargen. Den minst invasive tilnærmingen for å målrette mot hele sentralnervesystemet involverer injeksjon i cerebrospinalvæsken (CSF), slik at terapien kan nå en stor brøkdel av sentralnervesystemet. Den sikreste tilnærmingen for å levere en vektor inn i CSF er den lumbale intratekale injeksjonen, hvor en nål føres inn i lumbalcisternen i ryggmargen. Denne teknikken, også kjent som en lumbalpunksjon, har blitt mye brukt hos nyfødte og voksne gnagere og i store dyremodeller. Selv om teknikken er lik på tvers av arter og utviklingsstadier, krever subtile forskjeller i størrelse, struktur og elastisitet av vev som omgir det intratekale rommet tilpasninger i tilnærmingen. Denne artikkelen beskriver en metode for å utføre lumbalpunksjon hos unge rotter for å levere en adeno-assosiert serotype 9-vektor. Her ble 25-35 μL vektor injisert i lumbalsisternen, og en grønn fluorescerende protein (GFP) reporter ble brukt til å evaluere transduksjonsprofilen som følge av hver injeksjon. Fordelene og utfordringene med denne tilnærmingen diskuteres.
Introduction
Løftet om virusmedierte genterapier har endelig blitt realisert de siste årene med FDA-godkjenning av behandlinger for spinal muskelatrofi, retinal dystrofi, faktor IX hemofili, kreft og mer 1,2,3,4. Utallige andre terapier er for tiden under utvikling. Genterapi tar sikte på å levere et terapeutisk gen til pasientens celler. Produktene til dette nye genet kan erstatte den manglende aktiviteten fra et mangelfullt endogent gen, hemme et giftig gen, drepe kreftceller eller gi en annen gunstig funksjon.
For sykdommer som påvirker sentralnervesystemet (CNS), er det ofte ønskelig å levere genterapivektoren direkte til målvevet. Ikke-systemiske tilnærminger gir to fordeler: de minimerer bivirkninger utenfor målet som kan være forårsaket av perifer transduksjon, og de reduserer mengden vektor som trengs for å oppnå tilstrekkelige transduksjonsnivåer i målvevet5.
Det finnes en rekke tilnærminger for å levere genterapivektorer til CNS. Intraparenkymal injeksjon, injeksjon av en vektor direkte i ryggmargen eller hjernevevet, kan brukes til levering til et definert område. For mange sykdommer er det imidlertid ønskelig med bred transduksjon av CNS. Dette kan oppnås ved å levere en vektor til cerebrospinalvæsken (CSF)5, væsken som strømmer i og rundt hjernen og ryggmargen. Det er tre primære måter å levere vektorer til CSF på. Den mest invasive tilnærmingen er intracerebroventrikulær levering, som innebærer å bore et borehull gjennom hodeskallen og føre en nål gjennom hjernen inn i laterale ventrikler. Dette gir transduksjon i hele hjernen. Imidlertid kan prosedyren forårsake intrakraniell blødning, og tilnærmingen gir generelt bare begrenset transduksjon av ryggmargen6. Injeksjon i cisterna magna ved bunnen av hodeskallen er mindre invasiv, men medfører risiko for skade på hjernestammen. Selv om det ofte brukes i dyreforsøk5, brukes injeksjon i cisterna magna ikke lenger rutinemessig i klinikken7. Lumbalpunksjon er den minst invasive tilnærmingen for å få tilgang til CSF. Dette innebærer å plassere en nål mellom to korsryggvirvler og inn i korsryggen.
Lumbalpunksjon for vektorlevering utføres rutinemessig hos voksne rotter og mus og hos nyfødte mus 8,9. Forfatterne av denne studien utførte nylig lumbalpunksjoner hos unge rotter (28-30 dager gamle) for å levere adeno-assosierte virusserotype 9 (AAV9) vektorer. Hos voksne rotter ble en neonatal lumbal punksjonsnål plassert vertikalt mellom L3- og L4-ryggvirvlene9. Riktig plassering resulterer i en haleflikk og CSF som strømmer opp i nålereservoaret. Hos unge rotter kunne imidlertid ingen av disse avlesningene oppnås. Forfatterne forsøkte deretter å tilpasse en voksen museprosedyre ved hjelp av en 27 G insulinsprøyte satt inn i en vinkel mellom L5 og L610. Hos voksne mus, som vanligvis er mindre enn P28-rotter, gir dette ikke en haleflikk, men feil nåleplassering er tydelig ved tilbakestrømningen av injektatet. Hos unge rotter førte imidlertid denne tilnærmingen jevnt til at injekatet ble levert epiduralt, sannsynligvis som følge av ulik elastisitet mellom voksne mus og unge rotter i vevslagene rundt ryggmargen. Katetertilnærminger ble deretter evaluert. Nærmere bestemt ble et kateter introdusert gjennom et snitt i dura av lumbalsisternen og opp til midten av thorax ryggmargen; Denne tilnærmingen førte imidlertid til betydelig refluks av injektatet tilbake ut av snittstedet under fødselen. Forsøk på å plassere kateteret i det intratekale rommet perkutant ved hjelp av en guidenål var heller mislykket. På grunn av smalheten i den interlaminære bredden, vil kateteret sannsynligvis treffe rostral lamina og ikke komme frem.
Her beskrives en metode for å oppnå vellykket og reproduserbar løsningstilførsel via lumbalpunksjon hos ungrotte. Denne tilnærmingen kan brukes for virale vektorer, og sannsynligvis også for celler, legemidler og andre terapier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Et bredt utvalg av sykdommer påvirker CNS. Å gi en funksjonell kopi av det aktuelle genet via en viral vektor er en attraktiv behandlingsstrategi for de som er recessive og monogene i naturen, for eksempel spinal muskelatrofi. Blod-hjerne-barrieren (BBB) utelukker imidlertid de fleste genterapivektorer gitt intravenøst11. De som kan krysse BBB, for eksempel AAV9, må gis i høye doser for å overvinne vektortapet på grunn av perifer transduksjon12. Alderen er også en b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gjerne takke Steven Gray, Matthew Rioux, Nanda Regmi og Lacey Stearman fra UT Southwestern for en produktiv diskusjon om utfordringen med unge rotter for intratekal injeksjon. Dette arbeidet ble delvis støttet av midler fra Jaguar Gene Therapy (til JLFK).
Materials
| 200 µL filtered pipette tips | MidSci | PR-200RK-FL | Pipetting virus |
| AAV9-GFP | Vector Builder | P200624-1005ynr | AAV9 vector expressing GFP |
| Absorbable Suture with Needle Coated Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Size 4 – 0 Braided | McKesson | J422H | Suture |
| Bench pad | VWR | 56616-031 | Surgery |
| Braintree Scientific Isothermal Pads, 8'' x 8'' | Fisher Scientific | 50-195-4664 | Maintains body temperature |
| Buprenorphine | McKesson | 1013922 | Analgesic |
| Buprenorphine-ER (1 mg/mL) | Zoopharma | Extended-release analgesic | |
| Cotton swabs | Fisher Scientific | 19-365-409 | Blood removal |
| Drape, Mouse, Clear Plastic, 12" x 12", with Adhesive Fenestration | Steris | 1212CPSTF | Surgical drape |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Forceps |
| Electric Blanket | CVS Health | CVS Health Series 500 Extra Long Heating Pad | |
| Eppendorf Research plus, 1-channel pipette, variable, 20–200 µL | Eppendorf | 3123000055 | Pipetting virus |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | Curved surgical scissors |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | 16121-14 | Laminectomy |
| Halsey Needle Holders | Fine Science Tools | 12001-13 | Needle driver |
| Insulin Syringes with Ultra-Fine Needle 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc | BD | 328431 | Syringe |
| Isoflurane | McKesson | 803250 | Anesthetic |
| Isopropanol wipes | Fisher Scientific | 22-031-350 | Skin disinfection |
| Lidocaine, 1% | McKesson | 239935 | Local anesthesia |
| Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-137 | Loading the syringe |
| Povidone-iodine | Fisher Scientific | 50-118-0481 | Skin disinfection |
| Scalpel Handle – #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Scalpel blade holder |
| Sure-Seal Induction Chamber | Braintree Scientific | EZ-17 | Anesthesia box |
| Surgical Blade Miltex Carbon Steel No. 11 Sterile Disposable Individually Wrapped | McKesson | 4-111 | #11 Scalpel blade |
| SYSTANE NIGHTTIME Eye Ointment | Alcon | Eye ointment | |
| Trypan Blue | VWR | 97063-702 | Injection |
References
- Wurster, C., Petri, S. Progress in spinal muscular atrophy research. Curr Opin Neurol. 35 (5), 693-698 (2022).
- Wu, K. Y., et al. Retinitis pigmentosa: Novel therapeutic targets and drug development. Pharmaceutics. 15 (2), 685 (2023).
- Larkin, H. First FDA-approved gene therapy for hemophilia. JAMA. 329 (1), 14 (2023).
- Lee, A. Nadofaragene firadenovec: First approval. Drugs. 83 (4), 353-357 (2023).
- Taghian, T., et al. A safe and reliable technique for CNS delivery of AAV vectors in the cisterna magna. Mol Ther. 28 (2), 411-421 (2020).
- Donsante, A., et al. Intracerebroventricular delivery of self-complementary adeno-associated virus serotype 9 to the adult rat brain. Gene Ther. 23 (5), 401-407 (2016).
- Pellot, J. E., Jesus, O. D. Suboccipital puncture. [Updated 2022 Jul 25]. StatPearls [Internet]. , (2022).
- Elliger, S. S., Elliger, C. A., Aguilar, C. P., Raju, N. R., Watson, G. L. Elimination of lysosomal storage in brains of MPS vii mice treated by intrathecal administration of an adeno-associated virus vector. Gene Ther. 6 (6), 1175-1178 (1999).
- De La Calle, J. L., Paino, C. L. A procedure for direct lumbar puncture in rats. Brain Res Bull. 59 (3), 245-250 (2002).
- O’connor, D. M., Lutomski, C., Jarrold, M. F., Boulis, N. M., Donsante, A. Lot-to-lot variation in adeno-associated virus serotype 9 (AAV9) preparations. Hum Gene Ther Methods. 30 (6), 214-225 (2019).
- Manfredsson, F. P., Rising, A. C., Mandel, R. J. AAV9: A potential blood-brain barrier buster. Mol Ther. 17 (3), 403-405 (2009).
- Hudry, E., Vandenberghe, L. H. Therapeutic AAV gene transfer to the nervous system: A clinical reality. Neuron. 101 (5), 839-862 (2019).
- Georg-Fries, B., Biederlack, S., Wolf, J., Zur Hausen, H. Analysis of proteins, helper dependence, and seroepidemiology of a new human parvovirus. Virology. 134 (1), 64-71 (1984).
- Schulz, M., et al. Binding and neutralizing anti-aav antibodies: Detection and implications for rAAV-mediated gene therapy. Mol Ther. 31 (3), 616-630 (2023).
- Gray, S. J., Nagabhushan Kalburgi, S., Mccown, T. J., Samulski, J. R. Global CNS gene delivery and evasion of anti-aav-neutralizing antibodies by intrathecal aav administration in non-human primates. Gene Ther. 20 (4), 450-459 (2013).
- Meyer, K., et al. Improving single injection CSF delivery of AAV9-mediated gene therapy for sma: A dose-response study in mice and non-human primates. Mol Ther. 23 (3), 477-487 (2015).
- Hinderer, C., et al. Evaluation of intrathecal routes of administration for adeno-associated viral vectors in large animals. Hum Gene Ther. 29 (1), 15-24 (2018).
- Wang, Y. F., et al. Cerebrospinal fluid leakage and headache after lumbar puncture: A prospective non-invasive imaging study. Brain. 138, 1492-1498 (2015).
- Hordeaux, J., et al. Adeno-associated virus-induced dorsal root ganglion pathology). Hum Gene Ther. 31 (15-16), 808-818 (2020).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 106-107, 1-16 (2013).
- Fang, H., et al. Comparison of adeno-associated virus serotypes and delivery methods for cardiac gene transfer. Hum Gene Ther Methods. 23 (4), 234-241 (2012).
.