Entrega de vetor intratecal em ratos juvenis por injeção de cisterna lombar
Summary
Um procedimento cirúrgico é descrito para realizar injeções na cisterna lombar do rato juvenil. Essa abordagem tem sido usada para a entrega intratecal de vetores de terapia gênica, mas prevê-se que essa abordagem possa ser usada para uma variedade de terapêuticas, incluindo células e medicamentos.
Abstract
A terapia gênica é uma tecnologia poderosa para fornecer novos genes a um paciente para o tratamento da doença, seja para introduzir um gene funcional, inativar um gene tóxico ou fornecer um gene cujo produto pode modular a biologia da doença. O método de entrega do vetor terapêutico pode assumir várias formas, desde a infusão intravenosa para administração sistêmica até a injeção direta no tecido-alvo. Para distúrbios neurodegenerativos, muitas vezes é desejável inclinar a transdução para o cérebro e/ou medula espinhal. A abordagem menos invasiva para atingir todo o sistema nervoso central envolve a injeção no líquido cefalorraquidiano (LCR), permitindo que a terapêutica atinja uma grande fração do sistema nervoso central. A abordagem mais segura para administrar um vetor no LCR é a injeção intratecal lombar, onde uma agulha é introduzida na cisterna lombar da medula espinhal. Essa técnica, também conhecida como punção lombar, tem sido amplamente utilizada em roedores neonatais e adultos e em modelos animais de grande porte. Embora a técnica seja semelhante entre espécies e estágios de desenvolvimento, diferenças sutis no tamanho, estrutura e elasticidade dos tecidos ao redor do espaço intratecal requerem acomodações na abordagem. Este artigo descreve um método para realizar punção lombar em ratos juvenis para fornecer um vetor adeno-associado do sorotipo 9. Aqui, 25-35 μL de vetor foram injetados na cisterna lombar, e um repórter de proteína fluorescente verde (GFP) foi usado para avaliar o perfil de transdução resultante de cada injeção. Os benefícios e desafios dessa abordagem são discutidos.
Introduction
A promessa de terapias genéticas mediadas por vírus foi finalmente realizada nos últimos anos com a aprovação do FDA de tratamentos para atrofia muscular espinhal, distrofia retiniana, hemofilia do fator IX, câncer e muito mais 1,2,3,4. Inúmeras outras terapias estão atualmente em desenvolvimento. A terapia gênica visa fornecer um gene terapêutico às células de um paciente. Os produtos desse novo gene podem substituir a atividade ausente de um gene endógeno deficiente, inibir um gene tóxico, matar células cancerígenas ou fornecer alguma outra função benéfica.
Para doenças que afetam o sistema nervoso central (SNC), a entrega do vetor de terapia gênica diretamente ao tecido-alvo é frequentemente desejável. As abordagens não sistêmicas oferecem dois benefícios: minimizam os efeitos colaterais fora do alvo que podem ser causados pela transdução periférica e reduzem muito a quantidade de vetor necessária para atingir níveis adequados de transdução no tecido-alvo5.
Há uma variedade de abordagens para fornecer vetores de terapia gênica ao SNC. A injeção intraparenquimatosa, a injeção de um vetor diretamente na medula espinhal ou no tecido cerebral, pode ser usada para entrega em uma região definida. No entanto, para muitas doenças, a transdução ampla do SNC é desejada. Isso pode ser feito entregando um vetor ao líquido cefalorraquidiano (LCR)5, o fluido que flui dentro e ao redor do cérebro e da medula espinhal. Existem três maneiras principais de fornecer vetores ao LCR. A abordagem mais invasiva é a entrega intracerebroventricular, que envolve a perfuração de um orifício no crânio e o avanço de uma agulha através do cérebro até os ventrículos laterais. Isso produz transdução por todo o cérebro. No entanto, o procedimento pode causar hemorragia intracraniana, e a abordagem geralmente produz apenas transdução limitada da medula espinhal6. A injeção na cisterna magna na base do crânio é menos invasiva, mas traz o risco de danos ao tronco cerebral. Embora frequentemente usada em pesquisas com animais5, a injeção na cisterna magna não é mais usada rotineiramente na clínica7. A punção lombar é a abordagem menos invasiva para acessar o LCR. Isso envolve colocar uma agulha entre duas vértebras lombares e na cisterna lombar.
A punção lombar para entrega do vetor é realizada rotineiramente em ratos e camundongos adultos e em camundongos neonatais 8,9. Os autores deste estudo realizaram recentemente punções lombares em ratos juvenis (28-30 dias de idade) para fornecer vetores do sorotipo 9 do vírus adeno-associado (AAV9). Em ratos adultos, uma agulha de punção lombar neonatal foi colocada verticalmente entre as vértebras L3 e L49. O posicionamento adequado resulta em um movimento da cauda e no LCR fluindo para o reservatório da agulha. Em ratos juvenis, porém, nenhuma dessas leituras pôde ser alcançada. Os autores então tentaram adaptar um procedimento de camundongo adulto usando uma seringa de insulina 27 G inserida em um ângulo entre L5 e L610. Em camundongos adultos, que normalmente são menores que os ratos P28, isso não produz um movimento da cauda, mas a colocação incorreta da agulha é evidente pelo refluxo do injetado. Em ratos juvenis, no entanto, essa abordagem levou uniformemente ao injetado ser administrado por via epidural, provavelmente resultante de diferentes elasticidades entre camundongos adultos e ratos juvenis das camadas de tecido ao redor da medula espinhal. As abordagens por cateter foram avaliadas em seguida. Especificamente, um cateter foi introduzido através de uma incisão na dura-máter da cisterna lombar e até a medula espinhal torácica média; no entanto, essa abordagem levou a um refluxo substancial do injetado de volta para fora do local da incisão durante o parto. As tentativas de colocar o cateter no espaço intratecal por via percutânea com agulha-guia também não tiveram sucesso. Devido à estreiteza da largura interlaminar, o cateter provavelmente atingiria a lâmina rostral e não avançaria.
Aqui, é descrito um método para obter uma entrega de solução bem-sucedida e reprodutível por meio de uma punção lombar no rato juvenil. Essa abordagem pode ser usada para vetores virais e, provavelmente, também para células, produtos farmacêuticos e outras terapêuticas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uma grande variedade de doenças afeta o SNC. Fornecer uma cópia funcional do gene relevante por meio de um vetor viral é uma estratégia de tratamento atraente para aqueles que são recessivos e monogênicos por natureza, como atrofia muscular espinhal. No entanto, a barreira hematoencefálica (BHE) exclui a maioria dos vetores de terapia gênica administrados por via intravenosa11. Aqueles que podem cruzar a BHE, como AAV9, devem ser administrados em altas doses para superar a perda vetorial d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a Steven Gray, Matthew Rioux, Nanda Regmi e Lacey Stearman, da UT Southwestern, por uma discussão produtiva sobre o desafio representado por ratos juvenis para injeção intratecal. Este trabalho foi parcialmente apoiado por financiamento da Jaguar Gene Therapy (para JLFK).
Materials
| 200 µL filtered pipette tips | MidSci | PR-200RK-FL | Pipetting virus |
| AAV9-GFP | Vector Builder | P200624-1005ynr | AAV9 vector expressing GFP |
| Absorbable Suture with Needle Coated Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Size 4 – 0 Braided | McKesson | J422H | Suture |
| Bench pad | VWR | 56616-031 | Surgery |
| Braintree Scientific Isothermal Pads, 8'' x 8'' | Fisher Scientific | 50-195-4664 | Maintains body temperature |
| Buprenorphine | McKesson | 1013922 | Analgesic |
| Buprenorphine-ER (1 mg/mL) | Zoopharma | Extended-release analgesic | |
| Cotton swabs | Fisher Scientific | 19-365-409 | Blood removal |
| Drape, Mouse, Clear Plastic, 12" x 12", with Adhesive Fenestration | Steris | 1212CPSTF | Surgical drape |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Forceps |
| Electric Blanket | CVS Health | CVS Health Series 500 Extra Long Heating Pad | |
| Eppendorf Research plus, 1-channel pipette, variable, 20–200 µL | Eppendorf | 3123000055 | Pipetting virus |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | Curved surgical scissors |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | 16121-14 | Laminectomy |
| Halsey Needle Holders | Fine Science Tools | 12001-13 | Needle driver |
| Insulin Syringes with Ultra-Fine Needle 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc | BD | 328431 | Syringe |
| Isoflurane | McKesson | 803250 | Anesthetic |
| Isopropanol wipes | Fisher Scientific | 22-031-350 | Skin disinfection |
| Lidocaine, 1% | McKesson | 239935 | Local anesthesia |
| Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-137 | Loading the syringe |
| Povidone-iodine | Fisher Scientific | 50-118-0481 | Skin disinfection |
| Scalpel Handle – #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Scalpel blade holder |
| Sure-Seal Induction Chamber | Braintree Scientific | EZ-17 | Anesthesia box |
| Surgical Blade Miltex Carbon Steel No. 11 Sterile Disposable Individually Wrapped | McKesson | 4-111 | #11 Scalpel blade |
| SYSTANE NIGHTTIME Eye Ointment | Alcon | Eye ointment | |
| Trypan Blue | VWR | 97063-702 | Injection |
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