Интратекальное введение вектора молодым крысам путем инъекции поясничного отдела цистерны
Summary
Описана хирургическая методика выполнения инъекций в поясничный резервуар молодого крыса. Этот подход использовался для интратекальной доставки векторов генной терапии, но ожидается, что этот подход может быть использован для различных терапевтических средств, включая клетки и лекарственные препараты.
Abstract
Генная терапия — это мощная технология доставки новых генов пациенту для лечения заболевания, будь то введение функционального гена, инактивация токсичного гена или предоставление гена, продукт которого может модулировать биологию заболевания. Метод доставки терапевтического вектора может принимать различные формы, начиная от внутривенной инфузии для системной доставки и заканчивая прямым введением в ткань-мишень. При нейродегенеративных расстройствах часто желательно смещение трансдукции в сторону головного и/или спинного мозга. Наименее инвазивный подход к воздействию, направленный на всю центральную нервную систему, включает в себя инъекции в спинномозговую жидкость (ликвор), что позволяет терапевтическому эффекту достичь значительной части центральной нервной системы. Наиболее безопасным подходом для введения вектора в спинномозговую жидкость является поясничная интратекальная инъекция, при которой игла вводится в поясничный резервуар спинного мозга. Этот метод, также известный как люмбальная пункция, широко используется у новорожденных и взрослых грызунов, а также на крупных моделях животных. Несмотря на то, что метод схож у разных видов и стадий развития, тонкие различия в размере, структуре и эластичности тканей, окружающих интратекальное пространство, требуют аккомодации в подходе. В данной статье описан метод проведения люмбальной пункции у молодых крыс с целью доставки аденоассоциированного вектора серотипа 9. Здесь 25-35 мкл вектора вводили в поясничный отдел позвоночника, а для оценки профиля трансдукции, полученного в результате каждой инъекции, использовали репортер зеленого флуоресцентного белка (GFP). Обсуждаются преимущества и проблемы такого подхода.
Introduction
Перспектива вирусно-опосредованной генной терапии, наконец, была реализована в последние годы с одобрением FDA методов лечения спинальной мышечной атрофии, дистрофии сетчатки, гемофилии фактора IX, рака и других заболеваний. В настоящее время в разработке находится бесчисленное множество других терапевтических средств. Генная терапия направлена на доставку терапевтического гена в клетки пациента. Продукты этого нового гена могут замещать недостающую активность дефицитного эндогенного гена, ингибировать токсичный ген, убивать раковые клетки или выполнять какую-либо другую полезную функцию.
При заболеваниях, поражающих центральную нервную систему (ЦНС), часто бывает желательно доставить вектор генной терапии непосредственно в ткань-мишень. Несистемные подходы имеют два преимущества: они минимизируют побочные эффекты, которые могут быть вызваны периферической трансдукцией, и значительно уменьшают количество вектора, необходимого для достижения адекватных уровней трансдукциив целевой ткани.
Существует множество подходов к доставке векторов генной терапии в ЦНС. Интрапаренхиматозная инъекция, то есть инъекция вектора непосредственно в спинной мозг или ткань головного мозга, может быть использована для доставки в определенную область. Однако при многих заболеваниях желательна широкая трансдукция ЦНС. Это может быть достигнуто путем доставки вектора к спинномозговой жидкости (СМЖ)5, жидкости, которая течет в головном и спинном мозге и вокруг них. Существует три основных способа доставки векторов в спинномозговую жидкость. Наиболее инвазивным подходом является внутримозговая доставка, которая включает в себя сверление отверстия в черепе и продвижение иглы через мозг в боковые желудочки. Это приводит к трансдукции по всему мозгу. Тем не менее, процедура может вызвать внутричерепное кровоизлияние, и этот подход обычно приводит лишь к ограниченной трансдукции спинного мозга6. Инъекция в большую цистерну у основания черепа менее инвазивна, но несет риск повреждения ствола мозга. Несмотря на то, что инъекции в большую цистерну часто используются в исследованиях на животных5, они больше не используются рутинно в клинике7. Люмбальная пункция является наименее инвазивным подходом к доступу к спинномозговой жидкости. Это включает в себя введение иглы между двумя поясничными позвонками и в поясничный бачок.
Люмбальная пункция для доставки вектора обычно выполняется у взрослых крыс и мышей, а также у неонатальных мышей 8,9. Авторы этого исследования недавно провели люмбальную пункцию у молодых крыс (в возрасте 28-30 дней) для доставки векторов аденоассоциированного вируса серотипа 9 (AAV9). У взрослых крыс неонатальная игла для люмбальной пункции была размещена вертикально между позвонками L3 и L49. Правильное размещение приводит к взмаху хвостом и стеканию спинномозговой жидкости в игольчатый резервуар. Однако у молодых крыс ни одно из этих показаний не могло быть достигнуто. Затем авторы попытались адаптировать процедуру на взрослой мыши, используя инсулиновый шприц с концентрацией 27 г, вставленный под углом между L5 и L610. У взрослых мышей, которые обычно меньше, чем крысы P28, это не приводит к взмаху хвоста, но неправильное размещение иглы очевидно по обратному потоку инъекции. Однако у молодых крыс этот подход одинаково приводил к эпидуральной стимуляции инъекции, что, вероятно, является результатом разной эластичности слоев тканей, окружающих спинной мозг у взрослых мышей и молодых крыс. Далее оценивались катетерные доступы. В частности, катетер вводили через разрез в твердой мозговой оболочке поясничного отдела и до средней части грудного отдела спинного мозга; Однако такой подход приводил к значительному оттоку инъекции обратно из места разреза во время родов. Попытки ввести катетер в интратекальное пространство чрескожно с помощью направляющей иглы также не увенчались успехом. Из-за узкой межслойной ширины катетер, скорее всего, заденет ростральную пластинку и не сможет продвинуться вперед.
В данной работе описан метод достижения успешной и воспроизводимой доставки раствора с помощью люмбальной пункции у молодых крыс. Этот подход может быть использован для вирусных векторов, а также, вероятно, для клеток, фармацевтических препаратов и других терапевтических средств.
Protocol
Representative Results
Discussion
Самые разнообразные заболевания поражают ЦНС. Предоставление функциональной копии соответствующего гена с помощью вирусного вектора является привлекательной стратегией лечения рецессивных и моногенных заболеваний, таких как спинальная мышечная атрофия. Тем не менее, гематоэнцефал…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Стивена Грея, Мэтью Риу, Нанду Регми и Лейси Стирман из Юго-Западного университета Техаса за продуктивное обсуждение проблемы, которую представляют молодые крысы при интратекальной инъекции. Эта работа была частично поддержана финансированием от Jaguar Gene Therapy (JLFK).
Materials
| 200 µL filtered pipette tips | MidSci | PR-200RK-FL | Pipetting virus |
| AAV9-GFP | Vector Builder | P200624-1005ynr | AAV9 vector expressing GFP |
| Absorbable Suture with Needle Coated Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Size 4 – 0 Braided | McKesson | J422H | Suture |
| Bench pad | VWR | 56616-031 | Surgery |
| Braintree Scientific Isothermal Pads, 8'' x 8'' | Fisher Scientific | 50-195-4664 | Maintains body temperature |
| Buprenorphine | McKesson | 1013922 | Analgesic |
| Buprenorphine-ER (1 mg/mL) | Zoopharma | Extended-release analgesic | |
| Cotton swabs | Fisher Scientific | 19-365-409 | Blood removal |
| Drape, Mouse, Clear Plastic, 12" x 12", with Adhesive Fenestration | Steris | 1212CPSTF | Surgical drape |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Forceps |
| Electric Blanket | CVS Health | CVS Health Series 500 Extra Long Heating Pad | |
| Eppendorf Research plus, 1-channel pipette, variable, 20–200 µL | Eppendorf | 3123000055 | Pipetting virus |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | Curved surgical scissors |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | 16121-14 | Laminectomy |
| Halsey Needle Holders | Fine Science Tools | 12001-13 | Needle driver |
| Insulin Syringes with Ultra-Fine Needle 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc | BD | 328431 | Syringe |
| Isoflurane | McKesson | 803250 | Anesthetic |
| Isopropanol wipes | Fisher Scientific | 22-031-350 | Skin disinfection |
| Lidocaine, 1% | McKesson | 239935 | Local anesthesia |
| Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-137 | Loading the syringe |
| Povidone-iodine | Fisher Scientific | 50-118-0481 | Skin disinfection |
| Scalpel Handle – #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Scalpel blade holder |
| Sure-Seal Induction Chamber | Braintree Scientific | EZ-17 | Anesthesia box |
| Surgical Blade Miltex Carbon Steel No. 11 Sterile Disposable Individually Wrapped | McKesson | 4-111 | #11 Scalpel blade |
| SYSTANE NIGHTTIME Eye Ointment | Alcon | Eye ointment | |
| Trypan Blue | VWR | 97063-702 | Injection |
References
- Wurster, C., Petri, S. Progress in spinal muscular atrophy research. Curr Opin Neurol. 35 (5), 693-698 (2022).
- Wu, K. Y., et al. Retinitis pigmentosa: Novel therapeutic targets and drug development. Pharmaceutics. 15 (2), 685 (2023).
- Larkin, H. First FDA-approved gene therapy for hemophilia. JAMA. 329 (1), 14 (2023).
- Lee, A. Nadofaragene firadenovec: First approval. Drugs. 83 (4), 353-357 (2023).
- Taghian, T., et al. A safe and reliable technique for CNS delivery of AAV vectors in the cisterna magna. Mol Ther. 28 (2), 411-421 (2020).
- Donsante, A., et al. Intracerebroventricular delivery of self-complementary adeno-associated virus serotype 9 to the adult rat brain. Gene Ther. 23 (5), 401-407 (2016).
- Pellot, J. E., Jesus, O. D. Suboccipital puncture. [Updated 2022 Jul 25]. StatPearls [Internet]. , (2022).
- Elliger, S. S., Elliger, C. A., Aguilar, C. P., Raju, N. R., Watson, G. L. Elimination of lysosomal storage in brains of MPS vii mice treated by intrathecal administration of an adeno-associated virus vector. Gene Ther. 6 (6), 1175-1178 (1999).
- De La Calle, J. L., Paino, C. L. A procedure for direct lumbar puncture in rats. Brain Res Bull. 59 (3), 245-250 (2002).
- O’connor, D. M., Lutomski, C., Jarrold, M. F., Boulis, N. M., Donsante, A. Lot-to-lot variation in adeno-associated virus serotype 9 (AAV9) preparations. Hum Gene Ther Methods. 30 (6), 214-225 (2019).
- Manfredsson, F. P., Rising, A. C., Mandel, R. J. AAV9: A potential blood-brain barrier buster. Mol Ther. 17 (3), 403-405 (2009).
- Hudry, E., Vandenberghe, L. H. Therapeutic AAV gene transfer to the nervous system: A clinical reality. Neuron. 101 (5), 839-862 (2019).
- Georg-Fries, B., Biederlack, S., Wolf, J., Zur Hausen, H. Analysis of proteins, helper dependence, and seroepidemiology of a new human parvovirus. Virology. 134 (1), 64-71 (1984).
- Schulz, M., et al. Binding and neutralizing anti-aav antibodies: Detection and implications for rAAV-mediated gene therapy. Mol Ther. 31 (3), 616-630 (2023).
- Gray, S. J., Nagabhushan Kalburgi, S., Mccown, T. J., Samulski, J. R. Global CNS gene delivery and evasion of anti-aav-neutralizing antibodies by intrathecal aav administration in non-human primates. Gene Ther. 20 (4), 450-459 (2013).
- Meyer, K., et al. Improving single injection CSF delivery of AAV9-mediated gene therapy for sma: A dose-response study in mice and non-human primates. Mol Ther. 23 (3), 477-487 (2015).
- Hinderer, C., et al. Evaluation of intrathecal routes of administration for adeno-associated viral vectors in large animals. Hum Gene Ther. 29 (1), 15-24 (2018).
- Wang, Y. F., et al. Cerebrospinal fluid leakage and headache after lumbar puncture: A prospective non-invasive imaging study. Brain. 138, 1492-1498 (2015).
- Hordeaux, J., et al. Adeno-associated virus-induced dorsal root ganglion pathology). Hum Gene Ther. 31 (15-16), 808-818 (2020).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 106-107, 1-16 (2013).
- Fang, H., et al. Comparison of adeno-associated virus serotypes and delivery methods for cardiac gene transfer. Hum Gene Ther Methods. 23 (4), 234-241 (2012).
.