Administración intratecal de vectores en ratas juveniles mediante inyección en cisterna lumbar
Summary
Se describe un procedimiento quirúrgico para realizar inyecciones en la cisterna lumbar de la rata juvenil. Este enfoque se ha utilizado para la administración intratecal de vectores de terapia génica, pero se prevé que este enfoque se pueda utilizar para una variedad de terapias, incluidas las células y los fármacos.
Abstract
La terapia génica es una poderosa tecnología para entregar nuevos genes a un paciente para el tratamiento de una enfermedad, ya sea para introducir un gen funcional, inactivar un gen tóxico o proporcionar un gen cuyo producto pueda modular la biología de la enfermedad. El método de administración del vector terapéutico puede adoptar muchas formas, desde la infusión intravenosa para la administración sistémica hasta la inyección directa en el tejido diana. En el caso de los trastornos neurodegenerativos, a menudo es deseable sesgar la transducción hacia el cerebro y/o la médula espinal. El enfoque menos invasivo para dirigirse a todo el sistema nervioso central implica la inyección en el líquido cefalorraquídeo (LCR), lo que permite que la terapia llegue a una gran fracción del sistema nervioso central. El método más seguro para inyectar un vector en el líquido cefalorraquídeo es la inyección intratecal lumbar, en la que se introduce una aguja en la cisterna lumbar de la médula espinal. Esta técnica, también conocida como punción lumbar, ha sido ampliamente utilizada en roedores neonatos y adultos y en modelos animales grandes. Si bien la técnica es similar en todas las especies y etapas de desarrollo, las diferencias sutiles en el tamaño, la estructura y la elasticidad de los tejidos que rodean el espacio intratecal requieren adaptaciones en el enfoque. En este artículo se describe un método para realizar la punción lumbar en ratas juveniles para administrar un vector adenoasociado al serotipo 9. Aquí, se inyectaron 25-35 μL de vector en la cisterna lumbar y se utilizó un reportero de proteína fluorescente verde (GFP) para evaluar el perfil de transducción resultante de cada inyección. Se discuten los beneficios y desafíos de este enfoque.
Introduction
La promesa de las terapias génicas mediadas por virus finalmente se ha hecho realidad en los últimos años con la aprobación de la FDA de tratamientos para la atrofia muscular espinal, la distrofia de retina, la hemofilia del factor IX, el cáncer y más 1,2,3,4. Un sinnúmero de otras terapias están actualmente en desarrollo. La terapia génica tiene como objetivo administrar un gen terapéutico a las células de un paciente. Los productos de este nuevo gen pueden reemplazar la actividad faltante de un gen endógeno deficiente, inhibir un gen tóxico, matar células cancerosas o proporcionar alguna otra función beneficiosa.
En el caso de las enfermedades que afectan al sistema nervioso central (SNC), suele ser deseable administrar el vector de terapia génica directamente al tejido diana. Los enfoques no sistémicos proporcionan dos beneficios: minimizan los efectos secundarios fuera del objetivo que pueden ser causados por la transducción periférica y reducen en gran medida la cantidad de vector necesaria para lograr niveles adecuados de transducción en el tejido objetivo5.
Existe una variedad de enfoques para administrar vectores de terapia génica al SNC. La inyección intraparenquimatosa, la inyección de un vector directamente en la médula espinal o el tejido cerebral, se puede utilizar para la administración a una región definida. Sin embargo, para muchas enfermedades, se desea una transducción amplia del SNC. Esto se puede lograr mediante la entrega de un vector al líquido cefalorraquídeo (LCR)5, el líquido que fluye dentro y alrededor del cerebro y la médula espinal. Hay tres formas principales de entregar vectores al CSF. El enfoque más invasivo es la administración intracerebroventricular, que consiste en perforar un orificio a través del cráneo y hacer avanzar una aguja a través del cerebro hasta los ventrículos laterales. Esto produce la transducción a través del cerebro. Sin embargo, el procedimiento puede causar hemorragia intracraneal, y el abordaje generalmente produce solo una transducción limitada de la médula espinal6. La inyección en la cisterna magna en la base del cráneo es menos invasiva, pero conlleva el riesgo de daño al tronco encefálico. Si bien se usa a menudo en la investigación con animales5, la inyección en la cisterna magna ya no se usa de manera rutinaria en la clínica7. La punción lumbar es el abordaje menos invasivo para acceder al líquido cefalorraquídeo. Consiste en colocar una aguja entre dos vértebras lumbares y dentro de la cisterna lumbar.
La punción lumbar para el parto del vector se realiza de forma rutinaria en ratas y ratones adultos y en ratones neonatos 8,9. Los autores de este estudio realizaron recientemente punciones lumbares en ratas jóvenes (28-30 días de edad) para administrar vectores del virus adenoasociado del serotipo 9 (AAV9). En ratas adultas, se colocó una aguja de punción lumbar neonatal verticalmente entre las vértebras L3 y L49. La colocación adecuada da como resultado un movimiento de la cola y el líquido cefalorraquídeo que fluye hacia el depósito de la aguja. Sin embargo, en ratas jóvenes, no se pudo lograr ninguna de estas lecturas. A continuación, los autores intentaron adaptar un procedimiento en ratones adultos utilizando una jeringa de insulina de 27 G insertada en un ángulo entre L5 y L610. En ratones adultos, que suelen ser más pequeños que las ratas P28, esto no produce un movimiento de la cola, pero la colocación incorrecta de la aguja es evidente por el reflujo de la inyección. Sin embargo, en ratas jóvenes, este enfoque condujo uniformemente a que la inyección se administrara por vía epidural, probablemente como resultado de la diferente elasticidad entre ratones adultos y ratas juveniles de las capas de tejido que rodean la médula espinal. A continuación, se evaluaron los abordajes de los catéteres. En concreto, se introdujo un catéter a través de una incisión en la duramadre de la cisterna lumbar y hasta la médula espinal torácica media; Sin embargo, este enfoque condujo a un reflujo sustancial del inyectado fuera del sitio de la incisión durante el parto. Los intentos de colocar el catéter en el espacio intratecal por vía percutánea utilizando una aguja guía tampoco tuvieron éxito. Debido a la estrechez del ancho interlaminar, es probable que el catéter golpee la lámina rostral y no avance.
Aquí, se describe un método para lograr una administración exitosa y reproducible de la solución a través de una punción lumbar en la rata juvenil. Este enfoque se puede utilizar para vectores virales y, probablemente, también para células, productos farmacéuticos y otras terapias.
Protocol
Representative Results
Discussion
Una amplia variedad de enfermedades afectan al SNC. Proporcionar una copia funcional del gen relevante a través de un vector viral es una estrategia de tratamiento atractiva para aquellos que son recesivos y de naturaleza monogénica, como la atrofia muscular espinal. Sin embargo, la barrera hematoencefálica (BHE) excluye la mayoría de los vectores de terapia génica administrados por vía intravenosa11. Aquellos que pueden atravesar la barrera hematoencefálica, como el AAV9, deben administrar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Steven Gray, Matthew Rioux, Nanda Regmi y Lacey Stearman de UT Southwestern por una discusión productiva sobre el desafío que plantean las ratas juveniles para la inyección intratecal. Este trabajo fue financiado en parte por Jaguar Gene Therapy (a JLFK).
Materials
| 200 µL filtered pipette tips | MidSci | PR-200RK-FL | Pipetting virus |
| AAV9-GFP | Vector Builder | P200624-1005ynr | AAV9 vector expressing GFP |
| Absorbable Suture with Needle Coated Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Size 4 – 0 Braided | McKesson | J422H | Suture |
| Bench pad | VWR | 56616-031 | Surgery |
| Braintree Scientific Isothermal Pads, 8'' x 8'' | Fisher Scientific | 50-195-4664 | Maintains body temperature |
| Buprenorphine | McKesson | 1013922 | Analgesic |
| Buprenorphine-ER (1 mg/mL) | Zoopharma | Extended-release analgesic | |
| Cotton swabs | Fisher Scientific | 19-365-409 | Blood removal |
| Drape, Mouse, Clear Plastic, 12" x 12", with Adhesive Fenestration | Steris | 1212CPSTF | Surgical drape |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Forceps |
| Electric Blanket | CVS Health | CVS Health Series 500 Extra Long Heating Pad | |
| Eppendorf Research plus, 1-channel pipette, variable, 20–200 µL | Eppendorf | 3123000055 | Pipetting virus |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | Curved surgical scissors |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | 16121-14 | Laminectomy |
| Halsey Needle Holders | Fine Science Tools | 12001-13 | Needle driver |
| Insulin Syringes with Ultra-Fine Needle 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc | BD | 328431 | Syringe |
| Isoflurane | McKesson | 803250 | Anesthetic |
| Isopropanol wipes | Fisher Scientific | 22-031-350 | Skin disinfection |
| Lidocaine, 1% | McKesson | 239935 | Local anesthesia |
| Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-137 | Loading the syringe |
| Povidone-iodine | Fisher Scientific | 50-118-0481 | Skin disinfection |
| Scalpel Handle – #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Scalpel blade holder |
| Sure-Seal Induction Chamber | Braintree Scientific | EZ-17 | Anesthesia box |
| Surgical Blade Miltex Carbon Steel No. 11 Sterile Disposable Individually Wrapped | McKesson | 4-111 | #11 Scalpel blade |
| SYSTANE NIGHTTIME Eye Ointment | Alcon | Eye ointment | |
| Trypan Blue | VWR | 97063-702 | Injection |
References
- Wurster, C., Petri, S. Progress in spinal muscular atrophy research. Curr Opin Neurol. 35 (5), 693-698 (2022).
- Wu, K. Y., et al. Retinitis pigmentosa: Novel therapeutic targets and drug development. Pharmaceutics. 15 (2), 685 (2023).
- Larkin, H. First FDA-approved gene therapy for hemophilia. JAMA. 329 (1), 14 (2023).
- Lee, A. Nadofaragene firadenovec: First approval. Drugs. 83 (4), 353-357 (2023).
- Taghian, T., et al. A safe and reliable technique for CNS delivery of AAV vectors in the cisterna magna. Mol Ther. 28 (2), 411-421 (2020).
- Donsante, A., et al. Intracerebroventricular delivery of self-complementary adeno-associated virus serotype 9 to the adult rat brain. Gene Ther. 23 (5), 401-407 (2016).
- Pellot, J. E., Jesus, O. D. Suboccipital puncture. [Updated 2022 Jul 25]. StatPearls [Internet]. , (2022).
- Elliger, S. S., Elliger, C. A., Aguilar, C. P., Raju, N. R., Watson, G. L. Elimination of lysosomal storage in brains of MPS vii mice treated by intrathecal administration of an adeno-associated virus vector. Gene Ther. 6 (6), 1175-1178 (1999).
- De La Calle, J. L., Paino, C. L. A procedure for direct lumbar puncture in rats. Brain Res Bull. 59 (3), 245-250 (2002).
- O’connor, D. M., Lutomski, C., Jarrold, M. F., Boulis, N. M., Donsante, A. Lot-to-lot variation in adeno-associated virus serotype 9 (AAV9) preparations. Hum Gene Ther Methods. 30 (6), 214-225 (2019).
- Manfredsson, F. P., Rising, A. C., Mandel, R. J. AAV9: A potential blood-brain barrier buster. Mol Ther. 17 (3), 403-405 (2009).
- Hudry, E., Vandenberghe, L. H. Therapeutic AAV gene transfer to the nervous system: A clinical reality. Neuron. 101 (5), 839-862 (2019).
- Georg-Fries, B., Biederlack, S., Wolf, J., Zur Hausen, H. Analysis of proteins, helper dependence, and seroepidemiology of a new human parvovirus. Virology. 134 (1), 64-71 (1984).
- Schulz, M., et al. Binding and neutralizing anti-aav antibodies: Detection and implications for rAAV-mediated gene therapy. Mol Ther. 31 (3), 616-630 (2023).
- Gray, S. J., Nagabhushan Kalburgi, S., Mccown, T. J., Samulski, J. R. Global CNS gene delivery and evasion of anti-aav-neutralizing antibodies by intrathecal aav administration in non-human primates. Gene Ther. 20 (4), 450-459 (2013).
- Meyer, K., et al. Improving single injection CSF delivery of AAV9-mediated gene therapy for sma: A dose-response study in mice and non-human primates. Mol Ther. 23 (3), 477-487 (2015).
- Hinderer, C., et al. Evaluation of intrathecal routes of administration for adeno-associated viral vectors in large animals. Hum Gene Ther. 29 (1), 15-24 (2018).
- Wang, Y. F., et al. Cerebrospinal fluid leakage and headache after lumbar puncture: A prospective non-invasive imaging study. Brain. 138, 1492-1498 (2015).
- Hordeaux, J., et al. Adeno-associated virus-induced dorsal root ganglion pathology). Hum Gene Ther. 31 (15-16), 808-818 (2020).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 106-107, 1-16 (2013).
- Fang, H., et al. Comparison of adeno-associated virus serotypes and delivery methods for cardiac gene transfer. Hum Gene Ther Methods. 23 (4), 234-241 (2012).
.