Intratekal vektorleverans hos unga råttor via injektion av ländryggscistern
Summary
Ett kirurgiskt ingrepp beskrivs för att utföra injektioner i ländryggscisternen hos den unga råttan. Detta tillvägagångssätt har använts för intratekal leverans av genterapivektorer, men det förväntas att detta tillvägagångssätt kan användas för en mängd olika terapier, inklusive celler och läkemedel.
Abstract
Genterapi är en kraftfull teknik för att leverera nya gener till en patient för behandling av sjukdom, vare sig det är för att introducera en funktionell gen, inaktivera en toxisk gen eller tillhandahålla en gen vars produkt kan modulera sjukdomens biologi. Leveransmetoden för den terapeutiska vektorn kan ta många former, allt från intravenös infusion för systemisk tillförsel till direkt injektion i målvävnaden. För neurodegenerativa sjukdomar är det ofta önskvärt att snedvrida transduktionen mot hjärnan och/eller ryggmärgen. Det minst invasiva tillvägagångssättet för att rikta in sig på hela det centrala nervsystemet innebär injektion i cerebrospinalvätskan (CSF), vilket gör att läkemedlet kan nå en stor del av det centrala nervsystemet. Det säkraste sättet att leverera en vektor till ryggmärgsvätskan är den intratekala injektionen i ländryggen, där en nål förs in i ryggmärgens ländryggscistern. Denna teknik, även känd som en lumbalpunktion, har använts i stor utsträckning hos neonatala och vuxna gnagare och i stora djurmodeller. Även om tekniken är likartad mellan arter och utvecklingsstadier, kräver subtila skillnader i storlek, struktur och elasticitet hos vävnader som omger det intratekala utrymmet anpassningar i tillvägagångssättet. Den här artikeln beskriver en metod för att utföra lumbalpunktion på unga råttor för att leverera en adenoassocierad serotyp 9-vektor. Här injicerades 25-35 μL vektor i ländryggscisternen, och en grön fluorescerande proteinrapportör (GFP) användes för att utvärdera transduktionsprofilen som blev resultatet av varje injektion. Fördelarna och utmaningarna med detta tillvägagångssätt diskuteras.
Introduction
Löftet om viralmedierade genterapier har äntligen realiserats under de senaste åren med FDA:s godkännande av behandlingar för spinal muskelatrofi, retinal dystrofi, faktor IX-hemofili, cancer och mer 1,2,3,4. Oräkneliga andra terapier är för närvarande under utveckling. Genterapi syftar till att leverera en terapeutisk gen till en patients celler. Produkterna av denna nya gen kan ersätta den saknade aktiviteten från en bristfällig endogen gen, hämma en toxisk gen, döda cancerceller eller ge någon annan fördelaktig funktion.
För sjukdomar som påverkar det centrala nervsystemet (CNS) är det ofta önskvärt att leverera genterapivektorn direkt till målvävnaden. Icke-systemiska tillvägagångssätt ger två fördelar: de minimerar biverkningar utanför målet som kan orsakas av perifer transduktion, och de minskar kraftigt mängden vektor som behövs för att uppnå tillräckliga nivåer av transduktion i målvävnaden5.
Det finns en mängd olika metoder för att leverera genterapivektorer till CNS. Intraparenkymal injektion, injektion av en vektor direkt i ryggmärgen eller hjärnvävnaden, kan användas för leverans till ett definierat område. För många sjukdomar är dock en bred transduktion av CNS önskvärd. Detta kan åstadkommas genom att leverera en vektor till cerebrospinalvätskan (CSF)5, den vätska som flödar i och runt hjärnan och ryggmärgen. Det finns tre huvudsakliga sätt att leverera vektorer till CSF. Det mest invasiva tillvägagångssättet är intracerebroventrikulär tillförsel, vilket innebär att man borrar ett borrhål genom skallen och för fram en nål genom hjärnan in i de laterala ventriklarna. Detta ger transduktion i hela hjärnan. Ingreppet kan dock orsaka intrakraniell blödning, och metoden ger i allmänhet endast begränsad transduktion av ryggmärgen6. Injektion i cisterna magna vid skallbasen är mindre invasiv, men medför risk för skador på hjärnstammen. Även om det ofta används i djurförsök5, används injektion i cisterna magna inte längre rutinmässigt på kliniken7. Ländryggspunktion är den minst invasiva metoden för att komma åt CSF. Detta innebär att man placerar en nål mellan två ländkotor och in i ländryggen.
Ländryggspunktion för vektortillförsel utförs rutinmässigt på vuxna råttor och möss och på neonatala möss 8,9. Författarna till denna studie utförde nyligen lumbalpunktioner på unga råttor (28-30 dagar gamla) för att leverera adenoassocierade virus serotyp 9 (AAV9) vektorer. Hos vuxna råttor placerades en neonatal lumbalpunktionsnål vertikalt mellan L3- och L4-kotorna9. Korrekt placering resulterar i en svansknyck och CSF som rinner upp i nålbehållaren. Hos unga råttor kunde dock ingen av dessa avläsningar uppnås. Författarna försökte sedan anpassa en procedur för vuxna möss med hjälp av en 27 G insulinspruta som sattes in i en vinkel mellan L5 och L610. Hos vuxna möss, som vanligtvis är mindre än P28-råttor, ger detta inte en svansknyck, men felaktig nålplacering är uppenbar genom återflödet av injektatet. Hos unga råttor ledde dock detta tillvägagångssätt enhetligt till att injektatet levererades epiduralt, sannolikt på grund av olika elasticitet mellan vuxna möss och unga råttor i vävnadslagren som omger ryggmärgen. Katetermetoder utvärderades härnäst. Specifikt infördes en kateter genom ett snitt i dura i ländryggscisternen och upp till mitten av bröstkorgens ryggmärg; Detta tillvägagångssätt ledde dock till ett betydande återflöde av injektatet tillbaka ut ur snittstället under förlossningen. Försök att placera katetern perkutant i det intratekala utrymmet med hjälp av en styrkanyl misslyckades också. På grund av den smala bredden mellan laminärerna skulle katetern sannolikt träffa rostrallamina och misslyckas med att gå framåt.
Här beskrivs en metod för att uppnå framgångsrik och reproducerbar lösningsleverans via en lumbalpunktion hos den juvenila råttan. Detta tillvägagångssätt kan användas för virala vektorer, och sannolikt även för celler, läkemedel och andra terapier.
Protocol
Representative Results
Discussion
En mängd olika sjukdomar påverkar CNS. Att tillhandahålla en funktionell kopia av den relevanta genen via en viral vektor är en attraktiv behandlingsstrategi för dem som är recessiva och monogena till sin natur, såsom spinal muskelatrofi. Blod-hjärnbarriären (BBB) utesluter dock de flesta genterapivektorer som ges intravenöst11. De som kan passera BBB, såsom AAV9, måste ges i höga doser för att övervinna vektorförlusten på grund av perifer transduktion12. ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Steven Gray, Matthew Rioux, Nanda Regmi och Lacey Stearman från UT Southwestern för en produktiv diskussion om den utmaning som unga råttor utgör för intratekal injektion. Detta arbete stöddes delvis av finansiering från Jaguar Gene Therapy (till JLFK).
Materials
| 200 µL filtered pipette tips | MidSci | PR-200RK-FL | Pipetting virus |
| AAV9-GFP | Vector Builder | P200624-1005ynr | AAV9 vector expressing GFP |
| Absorbable Suture with Needle Coated Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Size 4 – 0 Braided | McKesson | J422H | Suture |
| Bench pad | VWR | 56616-031 | Surgery |
| Braintree Scientific Isothermal Pads, 8'' x 8'' | Fisher Scientific | 50-195-4664 | Maintains body temperature |
| Buprenorphine | McKesson | 1013922 | Analgesic |
| Buprenorphine-ER (1 mg/mL) | Zoopharma | Extended-release analgesic | |
| Cotton swabs | Fisher Scientific | 19-365-409 | Blood removal |
| Drape, Mouse, Clear Plastic, 12" x 12", with Adhesive Fenestration | Steris | 1212CPSTF | Surgical drape |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Forceps |
| Electric Blanket | CVS Health | CVS Health Series 500 Extra Long Heating Pad | |
| Eppendorf Research plus, 1-channel pipette, variable, 20–200 µL | Eppendorf | 3123000055 | Pipetting virus |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | Curved surgical scissors |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | 16121-14 | Laminectomy |
| Halsey Needle Holders | Fine Science Tools | 12001-13 | Needle driver |
| Insulin Syringes with Ultra-Fine Needle 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc | BD | 328431 | Syringe |
| Isoflurane | McKesson | 803250 | Anesthetic |
| Isopropanol wipes | Fisher Scientific | 22-031-350 | Skin disinfection |
| Lidocaine, 1% | McKesson | 239935 | Local anesthesia |
| Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-137 | Loading the syringe |
| Povidone-iodine | Fisher Scientific | 50-118-0481 | Skin disinfection |
| Scalpel Handle – #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Scalpel blade holder |
| Sure-Seal Induction Chamber | Braintree Scientific | EZ-17 | Anesthesia box |
| Surgical Blade Miltex Carbon Steel No. 11 Sterile Disposable Individually Wrapped | McKesson | 4-111 | #11 Scalpel blade |
| SYSTANE NIGHTTIME Eye Ointment | Alcon | Eye ointment | |
| Trypan Blue | VWR | 97063-702 | Injection |
References
- Wurster, C., Petri, S. Progress in spinal muscular atrophy research. Curr Opin Neurol. 35 (5), 693-698 (2022).
- Wu, K. Y., et al. Retinitis pigmentosa: Novel therapeutic targets and drug development. Pharmaceutics. 15 (2), 685 (2023).
- Larkin, H. First FDA-approved gene therapy for hemophilia. JAMA. 329 (1), 14 (2023).
- Lee, A. Nadofaragene firadenovec: First approval. Drugs. 83 (4), 353-357 (2023).
- Taghian, T., et al. A safe and reliable technique for CNS delivery of AAV vectors in the cisterna magna. Mol Ther. 28 (2), 411-421 (2020).
- Donsante, A., et al. Intracerebroventricular delivery of self-complementary adeno-associated virus serotype 9 to the adult rat brain. Gene Ther. 23 (5), 401-407 (2016).
- Pellot, J. E., Jesus, O. D. Suboccipital puncture. [Updated 2022 Jul 25]. StatPearls [Internet]. , (2022).
- Elliger, S. S., Elliger, C. A., Aguilar, C. P., Raju, N. R., Watson, G. L. Elimination of lysosomal storage in brains of MPS vii mice treated by intrathecal administration of an adeno-associated virus vector. Gene Ther. 6 (6), 1175-1178 (1999).
- De La Calle, J. L., Paino, C. L. A procedure for direct lumbar puncture in rats. Brain Res Bull. 59 (3), 245-250 (2002).
- O’connor, D. M., Lutomski, C., Jarrold, M. F., Boulis, N. M., Donsante, A. Lot-to-lot variation in adeno-associated virus serotype 9 (AAV9) preparations. Hum Gene Ther Methods. 30 (6), 214-225 (2019).
- Manfredsson, F. P., Rising, A. C., Mandel, R. J. AAV9: A potential blood-brain barrier buster. Mol Ther. 17 (3), 403-405 (2009).
- Hudry, E., Vandenberghe, L. H. Therapeutic AAV gene transfer to the nervous system: A clinical reality. Neuron. 101 (5), 839-862 (2019).
- Georg-Fries, B., Biederlack, S., Wolf, J., Zur Hausen, H. Analysis of proteins, helper dependence, and seroepidemiology of a new human parvovirus. Virology. 134 (1), 64-71 (1984).
- Schulz, M., et al. Binding and neutralizing anti-aav antibodies: Detection and implications for rAAV-mediated gene therapy. Mol Ther. 31 (3), 616-630 (2023).
- Gray, S. J., Nagabhushan Kalburgi, S., Mccown, T. J., Samulski, J. R. Global CNS gene delivery and evasion of anti-aav-neutralizing antibodies by intrathecal aav administration in non-human primates. Gene Ther. 20 (4), 450-459 (2013).
- Meyer, K., et al. Improving single injection CSF delivery of AAV9-mediated gene therapy for sma: A dose-response study in mice and non-human primates. Mol Ther. 23 (3), 477-487 (2015).
- Hinderer, C., et al. Evaluation of intrathecal routes of administration for adeno-associated viral vectors in large animals. Hum Gene Ther. 29 (1), 15-24 (2018).
- Wang, Y. F., et al. Cerebrospinal fluid leakage and headache after lumbar puncture: A prospective non-invasive imaging study. Brain. 138, 1492-1498 (2015).
- Hordeaux, J., et al. Adeno-associated virus-induced dorsal root ganglion pathology). Hum Gene Ther. 31 (15-16), 808-818 (2020).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 106-107, 1-16 (2013).
- Fang, H., et al. Comparison of adeno-associated virus serotypes and delivery methods for cardiac gene transfer. Hum Gene Ther Methods. 23 (4), 234-241 (2012).
.