Juvenil Sıçanlarda Lomber Sarnıç Enjeksiyonu ile İntratekal Vektör Verilmesi
Summary
Genç sıçanın bel sarnıcına enjeksiyon yapmak için cerrahi bir prosedür tarif edilmiştir. Bu yaklaşım, gen terapisi vektörlerinin intratekal verilmesi için kullanılmıştır, ancak bu yaklaşımın hücreler ve ilaçlar dahil olmak üzere çeşitli terapötikler için kullanılabileceği tahmin edilmektedir.
Abstract
Gen terapisi, işlevsel bir geni tanıtmak, toksik bir geni etkisiz hale getirmek veya ürünü hastalığın biyolojisini modüle edebilen bir gen sağlamak için olsun, hastalığın tedavisi için bir hastaya yeni genler sağlamak için güçlü bir teknolojidir. Terapötik vektör için uygulama yöntemi, sistemik uygulama için intravenöz infüzyondan hedef dokuya doğrudan enjeksiyona kadar birçok şekilde olabilir. Nörodejeneratif bozukluklar için, transdüksiyonun beyne ve / veya omuriliğe doğru çarpıtılması genellikle arzu edilir. Tüm merkezi sinir sistemini hedeflemek için en az invaziv yaklaşım, beyin omurilik sıvısına (BOS) enjeksiyonu içerir ve terapötiğin merkezi sinir sisteminin büyük bir kısmına ulaşmasını sağlar. Bir vektörü BOS’a iletmek için en güvenli yaklaşım, omuriliğin bel sarnıcına bir iğnenin sokulduğu lomber intratekal enjeksiyondur. Lomber ponksiyon olarak da bilinen bu teknik, yenidoğan ve yetişkin kemirgenlerde ve büyük hayvan modellerinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Teknik, türler ve gelişim aşamaları arasında benzer olsa da, intratekal boşluğu çevreleyen dokuların boyut, yapı ve elastikiyetindeki ince farklılıklar, yaklaşımda konaklama gerektirir. Bu makale, adeno ilişkili bir serotip 9 vektörü sağlamak için juvenil sıçanlarda lomber ponksiyon gerçekleştirme yöntemini açıklamaktadır. Burada lomber rezervuara 25-35 μL vektör enjekte edildi ve her enjeksiyondan elde edilen transdüksiyon profilini değerlendirmek için yeşil floresan protein (GFP) raportörü kullanıldı. Bu yaklaşımın yararları ve zorlukları tartışılmaktadır.
Introduction
Viral aracılı gen terapilerinin vaadi, son yıllarda spinal müsküler atrofi, retinal distrofi, faktör IX hemofili, kanser ve daha fazlası için tedavilerin FDA onayı ile nihayet gerçekleşmiştir 1,2,3,4. Sayısız başka terapötik şu anda geliştirilme aşamasındadır. Gen terapisi, bir hastanın hücrelerine terapötik bir gen iletmeyi amaçlar. Bu yeni genin ürünleri, eksik bir endojen genden eksik aktivitenin yerini alabilir, toksik bir geni inhibe edebilir, kanserli hücreleri öldürebilir veya başka bir yararlı işlev sağlayabilir.
Merkezi sinir sistemini (CNS) etkileyen hastalıklar için, gen terapisi vektörünün doğrudan hedef dokuya verilmesi genellikle arzu edilir. Sistemik olmayan yaklaşımlar iki fayda sağlar: periferik transdüksiyonun neden olabileceği hedef dışı yan etkileri en aza indirirler ve hedef dokuda yeterli transdüksiyon seviyelerine ulaşmak için gereken vektör miktarını büyük ölçüde azaltırlar5.
Gen terapisi vektörlerini CNS’ye iletmek için çeşitli yaklaşımlar vardır. Bir vektörün doğrudan omuriliğe veya beyin dokusuna enjekte edilmesi olan intraparankimal enjeksiyon, tanımlanmış bir bölgeye vermek için kullanılabilir. Bununla birlikte, birçok hastalık için, CNS’nin geniş transdüksiyonu arzu edilir. Bu, beyin ve omurilik içinde ve çevresinde akan sıvı olan beyin omurilik sıvısına (BOS)5 bir vektör verilerek gerçekleştirilebilir. Vektörleri CSF’ye iletmenin üç ana yolu vardır. En invaziv yaklaşım, kafatasından bir çapak deliği açmayı ve beyinden lateral ventriküllere bir iğne ilerletmeyi içeren intraserebroventriküler doğumdur. Bu, beyin boyunca transdüksiyon sağlar. Bununla birlikte, prosedür intrakraniyal kanamaya neden olabilir ve yaklaşım genellikle omuriliğin sadece sınırlı transdüksiyonunu sağlar6. Kafatasının tabanındaki cisterna magna’ya enjeksiyon daha az invazivdir, ancak beyin sapına zarar verme riski taşır. Hayvan araştırmalarında sıklıkla kullanılsada5, cisterna magna’ya enjeksiyon artık klinikte rutin olarak kullanılmamaktadır7. Lomber ponksiyon, BOS’a erişmek için en az invaziv yaklaşımdır. Bu, iki bel omuru arasına ve bel sarnıcına bir iğne yerleştirilmesini içerir.
Vektör iletimi için lomber ponksiyon, yetişkin sıçanlarda ve farelerde ve yenidoğan farelerde rutin olarak gerçekleştirilir 8,9. Bu çalışmanın yazarları yakın zamanda adeno ilişkili virüs serotip 9 (AAV9) vektörleri sağlamak için genç sıçanlarda (28-30 günlük) lomber ponksiyonlar gerçekleştirdiler. Yetişkin sıçanlarda, L3 ve L4 omurları9 arasına dikey olarak bir neonatal lomber ponksiyon iğnesi yerleştirildi. Doğru yerleştirme, bir kuyruk hareketi ve BOS’un iğne haznesine akmasına neden olur. Bununla birlikte, genç sıçanlarda, bu okumaların hiçbiri elde edilemedi. Yazarlar daha sonra L5 ve L610 arasında bir açıyla yerleştirilmiş 27 G’lik bir insülin şırıngası kullanarak yetişkin bir fare prosedürünü uyarlamaya çalıştılar. Tipik olarak P28 sıçanlarından daha küçük olan yetişkin farelerde, bu bir kuyruk hareketine neden olmaz, ancak yanlış iğne yerleşimi, enjeksiyonun geri akışı ile belirgindir. Bununla birlikte, genç sıçanlarda, bu yaklaşım, muhtemelen yetişkin fareler ile omuriliği çevreleyen doku katmanlarının genç sıçanları arasındaki farklı elastikiyetten kaynaklanan, enjekte edilen enklavatın epidural olarak verilmesine eşit şekilde yol açmıştır. Daha sonra kateter yaklaşımları değerlendirildi. Spesifik olarak, lomber sarnıcın durasında ve orta torasik omuriliğe kadar bir kesiden bir kateter sokuldu; Bununla birlikte, bu yaklaşım, enjeksiyon sırasında enjeksiyonun insizyon bölgesinden önemli ölçüde geri akışına yol açmıştır. Kateteri bir kılavuz iğne kullanarak perkütan olarak intratekal boşluğa yerleştirme girişimleri de başarısız oldu. İnterlaminar genişliğin darlığı nedeniyle, kateter muhtemelen rostral laminaya çarpacak ve ilerleymeyecektir.
Burada, juvenil sıçanlarda lomber ponksiyon yoluyla başarılı ve tekrarlanabilir solüsyon iletimi elde etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşım viral vektörler için ve muhtemelen hücreler, farmasötikler ve diğer terapötikler için de kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Çok çeşitli hastalıklar CNS’yi etkiler. Viral bir vektör aracılığıyla ilgili genin fonksiyonel bir kopyasını sağlamak, spinal müsküler atrofi gibi doğası gereği resesif ve monogenik olanlar için çekici bir tedavi stratejisidir. Bununla birlikte, kan-beyin bariyeri (BBB), intravenöz olarak verilen gen terapisi vektörlerinin çoğunu dışlar11. AAV9 gibi BBB’yi geçebilenler, periferik transdüksiyon12’ye bağlı vektör kaybının üstesinden gelmek iç…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, UT Southwestern’den Steven Gray, Matthew Rioux, Nanda Regmi ve Lacey Stearman’a, intratekal enjeksiyon için genç sıçanların yarattığı zorluğun verimli bir tartışması için teşekkür eder. Bu çalışma kısmen Jaguar Gen Terapisi’nden (JLFK’ye) sağlanan fonlarla desteklendi.
Materials
| 200 µL filtered pipette tips | MidSci | PR-200RK-FL | Pipetting virus |
| AAV9-GFP | Vector Builder | P200624-1005ynr | AAV9 vector expressing GFP |
| Absorbable Suture with Needle Coated Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Size 4 – 0 Braided | McKesson | J422H | Suture |
| Bench pad | VWR | 56616-031 | Surgery |
| Braintree Scientific Isothermal Pads, 8'' x 8'' | Fisher Scientific | 50-195-4664 | Maintains body temperature |
| Buprenorphine | McKesson | 1013922 | Analgesic |
| Buprenorphine-ER (1 mg/mL) | Zoopharma | Extended-release analgesic | |
| Cotton swabs | Fisher Scientific | 19-365-409 | Blood removal |
| Drape, Mouse, Clear Plastic, 12" x 12", with Adhesive Fenestration | Steris | 1212CPSTF | Surgical drape |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Forceps |
| Electric Blanket | CVS Health | CVS Health Series 500 Extra Long Heating Pad | |
| Eppendorf Research plus, 1-channel pipette, variable, 20–200 µL | Eppendorf | 3123000055 | Pipetting virus |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | Curved surgical scissors |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | 16121-14 | Laminectomy |
| Halsey Needle Holders | Fine Science Tools | 12001-13 | Needle driver |
| Insulin Syringes with Ultra-Fine Needle 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc | BD | 328431 | Syringe |
| Isoflurane | McKesson | 803250 | Anesthetic |
| Isopropanol wipes | Fisher Scientific | 22-031-350 | Skin disinfection |
| Lidocaine, 1% | McKesson | 239935 | Local anesthesia |
| Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-137 | Loading the syringe |
| Povidone-iodine | Fisher Scientific | 50-118-0481 | Skin disinfection |
| Scalpel Handle – #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Scalpel blade holder |
| Sure-Seal Induction Chamber | Braintree Scientific | EZ-17 | Anesthesia box |
| Surgical Blade Miltex Carbon Steel No. 11 Sterile Disposable Individually Wrapped | McKesson | 4-111 | #11 Scalpel blade |
| SYSTANE NIGHTTIME Eye Ointment | Alcon | Eye ointment | |
| Trypan Blue | VWR | 97063-702 | Injection |
References
- Wurster, C., Petri, S. Progress in spinal muscular atrophy research. Curr Opin Neurol. 35 (5), 693-698 (2022).
- Wu, K. Y., et al. Retinitis pigmentosa: Novel therapeutic targets and drug development. Pharmaceutics. 15 (2), 685 (2023).
- Larkin, H. First FDA-approved gene therapy for hemophilia. JAMA. 329 (1), 14 (2023).
- Lee, A. Nadofaragene firadenovec: First approval. Drugs. 83 (4), 353-357 (2023).
- Taghian, T., et al. A safe and reliable technique for CNS delivery of AAV vectors in the cisterna magna. Mol Ther. 28 (2), 411-421 (2020).
- Donsante, A., et al. Intracerebroventricular delivery of self-complementary adeno-associated virus serotype 9 to the adult rat brain. Gene Ther. 23 (5), 401-407 (2016).
- Pellot, J. E., Jesus, O. D. Suboccipital puncture. [Updated 2022 Jul 25]. StatPearls [Internet]. , (2022).
- Elliger, S. S., Elliger, C. A., Aguilar, C. P., Raju, N. R., Watson, G. L. Elimination of lysosomal storage in brains of MPS vii mice treated by intrathecal administration of an adeno-associated virus vector. Gene Ther. 6 (6), 1175-1178 (1999).
- De La Calle, J. L., Paino, C. L. A procedure for direct lumbar puncture in rats. Brain Res Bull. 59 (3), 245-250 (2002).
- O’connor, D. M., Lutomski, C., Jarrold, M. F., Boulis, N. M., Donsante, A. Lot-to-lot variation in adeno-associated virus serotype 9 (AAV9) preparations. Hum Gene Ther Methods. 30 (6), 214-225 (2019).
- Manfredsson, F. P., Rising, A. C., Mandel, R. J. AAV9: A potential blood-brain barrier buster. Mol Ther. 17 (3), 403-405 (2009).
- Hudry, E., Vandenberghe, L. H. Therapeutic AAV gene transfer to the nervous system: A clinical reality. Neuron. 101 (5), 839-862 (2019).
- Georg-Fries, B., Biederlack, S., Wolf, J., Zur Hausen, H. Analysis of proteins, helper dependence, and seroepidemiology of a new human parvovirus. Virology. 134 (1), 64-71 (1984).
- Schulz, M., et al. Binding and neutralizing anti-aav antibodies: Detection and implications for rAAV-mediated gene therapy. Mol Ther. 31 (3), 616-630 (2023).
- Gray, S. J., Nagabhushan Kalburgi, S., Mccown, T. J., Samulski, J. R. Global CNS gene delivery and evasion of anti-aav-neutralizing antibodies by intrathecal aav administration in non-human primates. Gene Ther. 20 (4), 450-459 (2013).
- Meyer, K., et al. Improving single injection CSF delivery of AAV9-mediated gene therapy for sma: A dose-response study in mice and non-human primates. Mol Ther. 23 (3), 477-487 (2015).
- Hinderer, C., et al. Evaluation of intrathecal routes of administration for adeno-associated viral vectors in large animals. Hum Gene Ther. 29 (1), 15-24 (2018).
- Wang, Y. F., et al. Cerebrospinal fluid leakage and headache after lumbar puncture: A prospective non-invasive imaging study. Brain. 138, 1492-1498 (2015).
- Hordeaux, J., et al. Adeno-associated virus-induced dorsal root ganglion pathology). Hum Gene Ther. 31 (15-16), 808-818 (2020).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 106-107, 1-16 (2013).
- Fang, H., et al. Comparison of adeno-associated virus serotypes and delivery methods for cardiac gene transfer. Hum Gene Ther Methods. 23 (4), 234-241 (2012).
.