Summary
La matriz de bazo descelularizada (DSM) tiene aplicaciones prometedoras en el campo de la ingeniería de tejidos hepáticos. Este protocolo describe el procedimiento para preparar el DSM de rata, que incluye la recolección de bazo de rata, la descelularización de los mismos mediante perfusión y la evaluación del DSM resultante para confirmar sus características.
Abstract
El trasplante de hígado es el tratamiento primario para la enfermedad hepática en etapa terminal. Sin embargo, la escasez y la calidad inadecuada de los órganos de los donantes hacen necesario el desarrollo de terapias alternativas. Los hígados bioartificiales (BAL) que utilizan matriz hepática descelularizada (DLM) han surgido como soluciones prometedoras. Sin embargo, el abastecimiento de DLM adecuados sigue siendo un reto. Se ha explorado el uso de una matriz de bazo descelularizada (DSM) como base para las LBA, ofreciendo una alternativa fácilmente disponible. En este estudio, se recolectaron bazos de rata y se descelularizaron utilizando una combinación de ciclos de congelación-descongelación y perfusión con reactivos de descelularización. El protocolo preservó las microestructuras y componentes de la matriz extracelular (MEC) dentro del DSM. El proceso completo de descelularización duró aproximadamente 11 h, lo que dio como resultado un ECM intacto dentro del DSM. El análisis histológico confirmó la eliminación de componentes celulares conservando la estructura y composición de la MEC. El protocolo presentado proporciona un método integral para la obtención de DSM, ofreciendo aplicaciones potenciales en ingeniería de tejido hepático y terapia celular. Estos hallazgos contribuyen al desarrollo de enfoques alternativos para el tratamiento de la enfermedad hepática en etapa terminal.
Introduction
El trasplante hepático sigue siendo el único tratamiento definitivo para la enfermedad hepática terminal 1,2,3. Sin embargo, la escasez crítica y la disminución de la calidad de los órganos de los donantes han aumentado la necesidad de tratamientos alternativos4. En el ámbito de la medicina regenerativa, los hígados bioartificiales (BAL) que utilizan matriz hepática descelularizada (DLM) han surgido como soluciones prometedoras 5,6,7. El DLM conserva la estructura hepática original, incluida su intrincada red microvascular y los componentes de la MEC, lo que ofrece un andamio para crear BAL trasplantables que podrían aliviar las enfermedades hepáticas.
A pesar de la promesa, la adopción de esta tecnología se enfrenta a desafíos, especialmente en el abastecimiento de DLM adecuados. Los DLM derivados del ser humano son escasos, mientras que los de origen animal conllevan riesgos de transmisión de enfermedades y rechazo inmunológico. En un enfoque innovador, nuestra investigación ha explorado el uso de una matriz de bazo descelularizada (DSM) como base para las LBA 8,9,10,11. El bazo está más disponible en diversas situaciones médicas, como la hipertensión portal, la ruptura traumática, la púrpura trombocitopénica idiopática y la donación después de la muerte cardíaca. Por lo tanto, el bazo está más ampliamente disponible que el hígado para fines de investigación. Los pacientes que se han sometido a esplenectomías no sufren afecciones graves, lo que confirma aún más la prescindibilidad del bazo. El microambiente del bazo, particularmente la matriz extracelular y los sinusoides, es similar al del hígado. Esto hace que el bazo sea un órgano adecuado para la adhesión y proliferación celular en la investigación del trasplante de hepatocitos. Sobre la base de estos hallazgos, nuestras investigaciones anteriores han demostrado que los DSM comparten microestructuras y componentes comparables con los DLM y pueden apoyar la supervivencia y la función de los hepatocitos, incluida la producción de albúmina y urea. Además, se ha demostrado que los DSM mejoran la diferenciación hepática de las células madre mesenquimales de la médula ósea, lo que conduce a una funcionalidad mejorada y consistente.
Mediante el empleo de DSMs tratados con heparina, hemos diseñado BALs funcionales capaces de demostrar una anticoagulación efectiva a corto plazo y una compensación parcial de la función hepática11. En consecuencia, este DSM tridimensional es muy prometedor para el avance de la ingeniería de tejidos hepáticos y la terapia celular. En este trabajo, presentamos los métodos detallados de recolección de bazo de rata y preparación de DSM que preservan las microestructuras y componentes de la MEC.
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Protocol
Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética de los Experimentos con Animales de la Universidad de Xi'an Jiaotong y se llevó a cabo de acuerdo con las directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio.
1. Recolección de bazo
- Utilice ratas Sprague Dawley macho que pesen entre 250 y 280 g. Aloje a las ratas en habitaciones con temperatura y humedad controladas, y bríndeles comida y agua ad libitum, excepto en ayunas antes de la cirugía.
- Inyectar buprenorfina por vía subcutánea (0,05 mL/kg) como analgésico 1 h antes de la operación. Anestesiar a la rata por inhalación de isoflurano. Utilice un caudal de 1,5 L/min de isoflurano al 5% para la anestesia de inducción en una caja de plexiglás y mantenga la anestesia con un caudal de 0,6-0,8 L/min de isoflurano al 2% a través de una mascarilla. Confirme la profundidad de la anestesia pellizcando los dedos de los pies.
- Usa una afeitadora eléctrica para afeitar la piel de todo el abdomen. Asegure la rata en posición supina sobre la mesa quirúrgica. Inyectar 2 mL de solución salina heparinizada (1.000 U de heparina) a través de la vena dorsal del pene para lograr la anticoagulación sistémica. Desinfecte la piel afeitada con una solución de povidona yodada y cúbrala con un paño estéril.
- Haga una incisión cruciforme con tijeras quirúrgicas en el abdomen, exponga la cavidad abdominal estirándola con las pinzas hemostáticas y voltee el hígado hacia el diafragma. Exteriorizar el tracto gastrointestinal hacia el lado derecho del abdomen y cubrirlo con una gasa húmeda.
- Separe y corte cuidadosamente el ligamento esplenogástrico para exponer el hilio esplénico.
NOTA: En el abdomen izquierdo se puede identificar el bazo, que aparece como una estructura alargada de color rojizo, de aproximadamente 3,0 cm x 0,6 cm x 0,6 cm. - Separe y exponga gradualmente la arteria hepática común, la arteria gastroduodenal y la arteria esplénica mediante disección a lo largo del hilio esplénico. Ligar y cortar la arteria gastroduodenal y la arteria hepática común mientras disocia progresivamente el tejido circundante.
- Voltea el bazo hacia el lado derecho para exponer la aorta abdominal. Realice suavemente una disección roma y exponga la aorta abdominal y el tronco celíaco con hisopos de algodón. Colocar una sutura de seda 3-0, de aproximadamente 3 cm de longitud, por encima y por debajo de las ramas del tronco celíaco, y colocar una sutura de seda 6-0, de aproximadamente 10 cm de longitud, en la rama del tronco celíaco.
- Ligadura de la aorta abdominal por debajo y por encima de las ramas del tronco celíaco. Haga una pequeña incisión en la rama arterial. Levante suavemente la sutura de seda 6-0, inserte un catéter venoso de 24 G en la arteria esplénica a lo largo del tronco celíaco, y látelo y asegúrelo.
- Utilizando una bomba de jeringa a una velocidad de 4 mL/min, infunda solución salina normal heparinizada (25 U/mL) a un volumen de 50 mL. Al mismo tiempo, corte la vena porta como un canal de salida para permitir que el líquido infundido fluya fuera del bazo. El animal es sacrificado por exanguinación.
- Diseccionar cuidadosamente el tejido circundante del bazo, evitando dañar el páncreas, al tiempo que se conservan los principales vasos accesorios.
- Verifique si hay fugas alrededor del bazo, luego retire el bazo y el páncreas y enjuáguelos con solución salina normal.
NOTA: El bazo y el páncreas de las ratas están estrechamente conectados, con el páncreas envolviendo la arteria esplénica. Si el bazo se extirpa por separado, puede ser difícil ligar numerosos vasos sanguíneos pequeños. En este procedimiento, se extirpa el bazo junto con el páncreas. Después de la descelularización, el bazo y el páncreas se vuelven transparentes y la microvasculatura es visible, lo que facilita la preservación del bazo con vasos sanguíneos intactos. - Transfiera el bazo a un tubo de centrífuga de 50 ml lleno de solución salina normal y guárdelo en un congelador a -80 °C.
NOTA: El bazo y el catéter venoso insertados en la arteria esplénica se criopreservarán juntos para una conexión conveniente durante los experimentos de perfusión.
2. Descelularización del bazo
- Repita el ciclo de congelación-descongelación 3 veces en un recipiente estéril para lisar las células del bazo.
NOTA: El ciclo de congelación-descongelación es un método físico utilizado para la descelularización del andamio. El tejido del bazo se coloca en un congelador a -80 °C durante la noche para su congelación, luego se retira del ambiente a baja temperatura y se coloca en un baño de agua a temperatura ambiente o 37 °C para descongelar. Este proceso de congelación y descongelación se repite de 3 a 6 veces, lo que altera las membranas celulares y conduce a la lisis celular. - Configure un sistema de perfusión dentro de un banco limpio compuesto por una bomba peristáltica, un depósito de 2 L, un tubo de silicona con un diámetro interior de 2,4 mm y una trampa de burbujas (Figura 1).
- Llene el sistema de perfusión con agua desionizada (ddH2O) y manténgalo en funcionamiento durante 10 min.
- Transfiera con cuidado el bazo extraído al recipiente lleno de ddH2O.
- Conecte el tubo de silicona al catéter venoso que se ha insertado en la arteria esplénica.
- Iniciar la perfusión con ddH2O a una velocidad de 2 mL/min durante 30 min.
- Continuar la perfusión con ddH2O a una velocidad de 4 mL/min durante 30 min.
- Perfundir con una solución SDS al 0,1% (p/v) durante 4 h.
- Perfundir con una solución Triton X-100 al 1% (v/v) durante 2 h.
- Perfundir con PBS a una velocidad de 4 mL/min durante 4 h para lavar el DSM.
NOTA: Uso de la bomba peristáltica para la perfusión unidireccional de todos los líquidos. - Una vez completada la perfusión, ligar y seccionar las ramas vasculares entre el páncreas y el bazo, y luego extirpar el páncreas. Guarde el DSM en un tubo de centrífuga limpio y sellado de 50 mL, empapado en PBS que contenga un 10% de penicilina-estreptomicina a -20 °C, hasta que esté listo para su uso en futuros experimentos.
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Representative Results
Este protocolo utilizó una combinación de ciclos repetidos de congelación-descongelación y perfusión con reactivos de descelularización para la descelularización del bazo de rata. La descelularización completa del bazo se logró en aproximadamente 11 h (Figura 2A). A lo largo del proceso de descelularización, el color del bazo pasó gradualmente de un rojo intenso a un rojo claro moteado y, finalmente, a una apariencia blanca translúcida (Figura 2B). La morfología general permaneció relativamente intacta, con estructuras vasculares visibles (Figura 2B).
La tinción con hematoxilina-eosina confirmó la eliminación de componentes celulares, revelando una MEC intacta dentro del DSM. Esto está en marcado contraste con el bazo nativo, como se muestra en la Figura 3A, donde los núcleos celulares y los elementos citoplasmáticos son visibles. La ausencia de células se confirmó aún más mediante la tinción con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) y la medición del ADN residual (DSM: 10,1 ± 4 ng/mg de peso seco, bazo nativo: 6.200 ± 300 ng/mg de peso seco). Las imágenes de microscopía electrónica de barrido revelaron la caracterización ultraestructural del DSM, que mostró una estructura de panal después de la eliminación completa de linfocitos del bazo (Figura 3C). Esto indicó que la descelularización del bazo conservó la ultraestructura y la arquitectura del bazo normal. Para una evaluación más completa de las proteínas cruciales de la MEC presentes en el DSM, se empleó el tricrómico de Masson (Figura 3B) y la tinción con inmunofluorescencia. En concreto, el colágeno I (Figura 3D) y la fibronectina (Figura 3E) fueron el objetivo del análisis. Los resultados indicaron que tanto los componentes estructurales como los de la membrana basal de la MEC se conservaron de manera similar al bazo nativo.
Figura 1: La configuración experimental. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: El flujo de trabajo de la descelularización y los cambios morfológicos macroscópicos. (A) El flujo de trabajo de preparación de la matriz de bazo descelularizada. La descelularización completa del bazo se logró en aproximadamente 11 h. (B) Cambios morfológicos macroscópicos del bazo durante la preparación del DSM. Durante este proceso, el color del bazo pasó gradualmente de un rojo intenso a un rojo claro moteado y, finalmente, a una apariencia blanca translúcida. (B) 1. Después de repetidos ciclos de congelación-descongelación y antes de la descelularización. 2. Después de enjuagar con agua desionizada durante 1 h. 3. Después de la perfusión con SDS durante 4 h. 4. Después de la perfusión con Tritón durante 2 h. Abreviaturas: DSM = matriz de bazo descelularizada; SDS = dodecil sulfato de sodio; PBS = solución salina tamponada con fosfato; PS = penicilina-estreptomicina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Observaciones morfológicas de la matriz de bazo descelularizada. (A) Tinción de H&E; (B) Tinción tricrómica de Masson; (C) SEM; (D,E) Tinción por inmunofluorescencia de colágeno I y fibronectina; (F) Tinción de DAPI. Barras de escala = 50 μm (A, B, D-F), 5 μm (C). Abreviaturas: DSM = matriz de bazo descelularizada; H&E = hematoxilina-eosina; SEM = microscopía electrónica de barrido; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los LBA representan un enfoque eficaz para el tratamiento de la enfermedad hepática terminal, especialmente en los casos en que el trasplante hepático se ve obstaculizado por la escasez actual de órganos de donantes6. Una opción prometedora para la creación de BAL es la utilización de DLM, que preserva la MEC natural y la estructura vascular del hígado nativo. Sin embargo, la escasez de DLM humana y los riesgos potenciales de infección e inmunogenicidad asociados con la DLM animal plantean limitaciones significativas. Para abordar este desafío, proponemos una estrategia novedosa que implica el empleo de una matriz de bazo descelularizada (DSM) como andamiaje alternativo para las LBA 8,9,10,11. Los bazos son más fácilmente accesibles en varios escenarios clínicos y exhiben características similares a los hígados. En este trabajo, presentamos métodos detallados de recolección de bazo de rata y preparación de DSM que preservan las microestructuras y componentes de la MEC.
Un método de descelularización ideal eliminaría los componentes celulares manteniendo la estructura, composición y propiedades mecánicas originales de la MEC 12,13,14. Los métodos de descelularización abarcan tratamientos físicos, químicos y enzimáticos, cada uno con sus ventajas e inconvenientesdistintivos 15. Si bien estos métodos pueden eliminar parcialmente los componentes celulares, también pueden comprometer la composición, la estructura y la funcionalidad del ECM restante. La calidad de la descelularización puede verse influenciada por las variaciones en la densidad celular, el grosor de la matriz y la morfología del tejido en diferentes fuentes de tejido.
Hasta la fecha, no existe un estándar de oro para el proceso de descelularización. Por lo general, el simple empleo de cualquiera de estos métodos es inadecuado para minimizar los efectos adversos en la MEC y maximizar la eliminación del contenido celular. En consecuencia, el enfoque más eficaz se basa en las características del tejido, lo que requiere una combinación de estos métodos. En este estudio, utilizamos un protocolo que combinaba métodos físicos (ciclos de congelación-descongelación y perfusión) con métodos químicos (SDS y TritonX-100) para descelularizar el bazo de rata.
Los ciclos de congelación-descongelación promueven la lisis celular y el rápido desprendimiento de las células de la ECM16. Al mismo tiempo, la perfusión a través de la vasculatura nativa mejora significativamente la eficiencia de la descelularización y preserva la red vascular original17. El dodecil sulfato de sodio (SDS), que funciona como detergente iónico, disuelve de manera competente tanto las membranas celulares como las nucleares, lo que lleva a una eliminación más completa de los componentes citoplasmáticos y nucleares. Sin embargo, este proceso también inflige daños en la ultraestructura de la MEC debido al agotamiento de los glicosaminoglicanos (GAG) y el colágeno.
Las concentraciones elevadas de SDS se correlacionaron con una disminución del contenido de ADN residual y una menor resistencia mecánica dentro del andamio de ECM. Por el contrario, las concentraciones más bajas de SDS preservaron una mayor cantidad de colágeno e indujeron una menor desnaturalización de las proteínas de la MEC. Por el contrario, Triton X-100, que sirve como detergente no iónico, interrumpe eficazmente las interacciones lípido-lípido, lípido-proteína y ADN-proteína, ofreciendo un enfoque más suave para la disolución de la membrana celular. Sin embargo, resulta inadecuado para la eliminación completa de los núcleos celulares y el ADN. Por lo tanto, debe combinarse con bajas concentraciones de SDS y tratamientos físicos para garantizar la eliminación completa de los componentes celulares mientras se conserva la estructura, composición y rendimiento originales de la MEC. Es importante tener en cuenta que los detergentes residuales pueden tener cierta citotoxicidad, por lo que es necesario un enjuague posterior al tratamiento con PBS estéril o agua destilada antes del almacenamiento.
Una limitación de este protocolo es la ausencia de cuantificación para SDS residual y Triton X-100. Esta decisión se basa tanto en la experiencia de nuestro equipo como en los informes que lo corroboran, que sugieren que un lavado de PBS de 4 horas es suficiente para eliminar estas sustancias de manera efectiva. Además, nuestros experimentos previos de cultivo celular que emplean este protocolo no han demostrado ningún signo de citotoxicidad. Para minimizar los gastos del protocolo, se tomó la decisión deliberada de renunciar a la cuantificación de los detergentes residuales.
En conclusión, este protocolo presenta un método factible para la preparación de DSMs, demostrando eficiencia, estabilidad y mínima invasividad. Los DSMs preparados con este protocolo mantienen la arquitectura, la composición y la red vascular natural inherentes al bazo. Además, ofrece un andamio para la implantación celular y el cultivo dinámico tridimensional, estableciendo así una base para avanzar en las investigaciones en el hígado de ingeniería tisular.
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Disclosures
Los autores han declarado no tener conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82000624), el Programa de Investigación Básica de Ciencias Naturales de Shaanxi (2022JQ-899 y 2021JM-268), el Programa de Apoyo a la Capacidad de Innovación de la Provincia de Shaanxi (2023KJXX-030), el Plan Clave de Investigación y Desarrollo de la Provincia de Shaanxi, el Proyecto Conjunto Universitario-Proyecto Clave (2021GXLH-Z-047), la Fundación Institucional del Primer Hospital Afiliado de la Universidad de Xi'an Jiaotong (2021HL-42 y 2021HL-21).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia Machine | Harvard Apparatus | tabletop | animal anesthesia |
| bubble trap | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd. | pore diameter: 5 μm | prevent air bubbles |
| Buprenorphine | TIPR Pharmaceutical Responsible Co.,Ltd | an analgesic | |
| Hemostatic Forceps | Shanghai Medical Instruments Co., Ltd | J31020 | surgical tool |
| Heparinized Saline | SPH No.1 Biochemical & Pharmaceutical Co., LTD | prevent the formation of thrombosis | |
| Isoflurane | RWD life Science Co. | anesthetic:for the induction and maintenanceof anesthesia | |
| Penicillin-Streptomycin | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | C0222 | antibiotics in vitro to prevent microbial contamination |
| Peristaltic Pump | Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd. | BT100-1L | |
| Phosphate-Buffered Saline | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 4481228 | phosphoric acid buffer salt solution |
| Silicone Tube | Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd. | 2.4×0.8mm | |
| Silk Suture | Yangzhou Jinhuan Medical Instrument Factory | 6-0 and 3-0 | ligate blood vessels |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 151-21-3 | ionic detergent, dissolves both cell and nuclear membranes |
| Syringe Pump | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd | BeneFusion SP5 | intravenous infusion |
| Triton X-100 | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 9002-93-1 | non-ionic detergent, disrupts lipid-lipid, lipid-protein, and DNA-protein interactions |
| Venous Catheter | B. Braun Company | 24G | inserting the spleen artery |
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