Summary
L’importance des petites colonies dans la résistance aux médicaments de Candida spp. n’a pas été pleinement explorée. La thérapie photodynamique antimicrobienne (aPDT) offre une stratégie prometteuse contre les infections fongiques résistantes aux médicaments. Cette étude démontre que l’aPDT médiée par le bengale de la rose désactive efficacement Candida glabrata et induit de petites colonies, présentant une procédure unique.
Abstract
Face à un taux de mortalité de 40 % chez les patients atteints de candidémie, le Candida résistant aux médicaments et ses petits mutants restent un défi thérapeutique majeur. La thérapie photodynamique antimicrobienne (aPDT) cible plusieurs structures fongiques, contrairement aux antibiotiques/antifongiques, ce qui peut contrecarrer la résistance. Les méthodes traditionnelles pour induire de petites colonies reposent sur le bromure d’éthidium ou le fluconazole, qui peuvent influencer la sensibilité aux médicaments et les réponses au stress. Cette étude a porté sur l’application d’un photosensibilisant à la lumière verte (pic de 520 nm) et au rose-bengale (RB) pour lutter contre un isolat de Candida glabrata résistant aux médicaments. Les résultats ont révélé que le traitement aPDT inhibait significativement la croissance cellulaire (réduction de ≥99,9 %) et induisait efficacement la formation de petites colonies, comme en témoigne la réduction de la taille et la perte de la coloration indicatrice redox mitochondriale. Cette étude fournit des preuves initiales que l’aPDT peut induire de petites colonies dans une souche de C. glabrata multirésistante in vitro, offrant une approche potentiellement transformatrice pour lutter contre les infections fongiques résistantes.
Introduction
Les infections fongiques, en particulier celles causées par Candida albicans et Candida glabrata, de plus en plus résistant aux médicaments, constituent une grave menace mondiale1. Ces infections peuvent être mortelles, en particulier pour les patients hospitalisés et ceux dont le système immunitaire est affaibli. L’augmentation de la résistance aux antifongiques menace le contrôle de la candidose invasive, une infection fongique grave avec une mortalité élevée, en particulier de Candida albicans2. Les souches résistantes entravent l’efficacité du traitement, ce qui peut augmenter à la fois la complexité et les taux de mortalité. Dans le comté d’Alameda, en Californie, aux États-Unis, C. glabrata est devenu l’espèce envahissante la plus répandue3. Ce changement dans la prévalence et la distribution des espèces de Candida peut être influencé par les pratiques de soins de santé locales, la démographie des patients, l’utilisation d’agents antifongiques et la prévalence des facteurs de risque d’infections à Candida.
De petits mutants chez Candida, dépourvus de mitochondries fonctionnelles, révèlent comment cet organite affecte la réponse aux médicaments, la virulence et la résistance au stress 4,5. C. glabrata forme facilement ces colonies, gagnant en sensibilité aux polyènes tout en les perdant au profit des azoles6. La sensibilité aux azoles et la fonction respiratoire sont intimement liées, la diminution de la respiration entraînant une résistance via la perte d’ADN mitochondrial7. De petites colonies de C. glabrata résistantes aux azoles ont été isolées à partir d’échantillons de selles humaines provenant d’un receveur d’une greffe de moelle osseuse subissant un traitement au fluconazole8 et de flacons d’hémoculture de patients atteints d’infections du sang9. Leurs implications potentielles dans la résistance aux médicaments, la virulence et la réponse au stress mettent en évidence leur signification clinique. De plus, leurs propriétés distinctes en font des outils précieux pour étudier des questions fondamentales en biologie mitochondriale5. Au fur et à mesure que la recherche sur les petits mutants se poursuit, leurs applications dans la recherche clinique et fondamentale sont susceptibles de s’étendre.
Cette étude a révélé que la thérapie photodynamique (PDT) peut induire de petites colonies chez C. glabrata, élargissant ainsi la gamme de méthodes au-delà des techniques traditionnelles d’exposition de C. glabrata au bromure d’éthidium ou au fluconazole.
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Protocol
1. Élevage de C. glabrata
REMARQUE : Un C. glabrata multirésistant (C2-1000907) résistant à la plupart des agents antifongiques, y compris le fluconazole, est utilisé pour les expériences. Il peut être nécessaire d’adapter les conditions expérimentales à la souche spécifique, car il peut exister des variations entre les différentes souches. Toutes les expériences ont utilisé du Candida en phase logarithmique cultivé à 25 °C (imitant l’infection naturelle) pour plus de cohérence. L’absence d’hyphes de C. glabrata simplifie la quantification par rapport à C. albicans, qui forme des hyphes à 37 °C10.
- Pour préparer une culture en phase logarithmique de C. glabrata, prélever une seule colonie dans une plaque de gélose et la transférer dans un tube à essai en verre avec 3 mL de milieu stérile de peptone dextrose (YPD) (voir le tableau des matériaux). Incuber pendant 14 à 16 h à 25 °C avec agitation (155 tr/min, angle de 45° pour augmenter la transmission de l’air vers le fluide).
- Après l’incubation, diluer la culture avec du YPD frais à une DO600 de 0,1 en utilisant une technique stérile. Incuber à 25 °C pendant 6 h en secouant à 155 tr/min. Vérifier la phase logarithmique de C. glabrata en mesurant la DO600. Visez 0,65-1,00, ce qui correspond à 1 × 10 7-1,5 × 107 cellules/mL.
2. Induction de petites colonies par bromure d’éthidium, fluconazole et thérapie photodynamique
- Induction de la petite colonie de bromure d’éthidium
- Ajuster une suspension de levure à une DO600 de 0,1 (5 × 10à 6 cellules/mL) avec YPD jusqu’à un volume final de 3 mL, puis ajouter 30 μL de bromure d’éthidium (10 mg/mL) (voir le tableau des matières) pour une concentration finale de 100 μg/mL.
- Incuber la suspension de levure pendant la nuit (16-18 h) à 25 °C, 155 tr/min, angle de 45°. Ajuster à une DO600 de 0,65 (1 × 107 cellules/mL). Effectuer une série de dilutions 10 fois dans une plaque de 96 puits en ajoutant 20 μL de suspension de levure ajustée à 180 μL de PBS par puits. Cela crée six dilutions allant de 10-1 à 10-5.
- Choisir 4 facteurs de dilution (p. ex., 100, 101, 102 et 103) et 3 gouttes (20 μL) sur 4 quadrants de gélose YPD (en trois exemplaires).
- Incuber les assiettes pendant la nuit à 37 °C. Sélectionnez des quadrants avec 5 à 80 colonies à partir des dilutions précédemment choisies pour la coloration au chlorure de triphényltétrazolium (TTC)11 (voir étape 3). Numérisez des plaques à 1200 dpi à l’aide d’un scanner optique couleur 48 bits.
- Induction de la petite colonie de fluconazole
REMARQUE : Pour accélérer le processus, utilisez des cellules T3 (un mélange de cellules normales et de cellules petites obtenues après 3 traitements RB-PDT ; voir l’étape 2.3) pour la formation de petites colonies induites par le fluconazole. En effet, le traitement standard entraîne généralement une formation plus lente.- Préparez et ajustez une suspension de cellules de levure comme décrit à l’étape 2.1.1.
- Incuber toute la nuit (16-18 h) à 25 °C. Réglez à nouveau l’OD600 sur 0,1.
- Transférez 1 mL de la suspension ajustée dans un tube stérile de 5 mL.
- Trempez un coton-tige stérile (15 cm de long, avec une pointe de 0,9 cm x 2,6 cm, voir tableau des matériaux) dans la suspension de levure, en assurant le contact avec le fond du tube et en tournant pour éliminer l’excès de liquide de la paroi du tube.
- Préparez les plaques dans la hotte à l’aide de gélose Mueller-Hinton (voir la table des matériaux).
- Tamponnez le coton d’avant en arrière sur la gélose, faites pivoter deux fois de 60°, puis tamponnez le périmètre pour une couverture uniforme.
- Stérilisez les pinces à feu pendant 1 à 2 secondes, en les laissant refroidir brièvement, puis utilisez-les pour ramasser les disques vierges.
- Divisez la plaque en trois secteurs égaux à l’aide d’un marqueur. Placez un disque vierge au centre de chaque secteur.
- Ajouter 12,5 μL de fluconazole (2 mg/mL, voir le tableau des matériaux) dans chaque disque (25 μg/disque), bien mélanger pour éviter les bulles et incuber à 37 °C pendant 20 à 24 h.
- Effectuez la coloration TTC (voir étape 3). Numérisez des plaques à 1200 dpi à l’aide d’un scanner optique couleur 48 bits.
- Induction de la petite colonie PDT
REMARQUE : Différents champignons peuvent produire un nombre différent de petites colonies après la PDT. Certaines souches peuvent ne pas en produire du tout.- Préparez le système aPDT.
REMARQUE : La procédure de configuration du dispositif du système aPDT suit la méthode décrite par Hung et al12. En bref, le système aPDT se compose d’un réseau de LED vertes avec un pic à 520 nm (voir le tableau des matériaux), éclairant la lumière par le bas avec un bon alignement avec chaque puits d’une plaque de 96 puits. - Ajustez la suspension de cellules de levure dans le milieu YPD à une DO600 de 0,65 (environ 1 × 10,7 cellules/mL).
- Mélanger 1 mL de suspension de levure avec 111 μL de rose bengale à 2 % (RB, Figure 1) (voir le tableau des matériaux) dans un tube à capuchon rond pour obtenir une concentration finale de RB de 0,2 %. Incuber le mélange à 25 °C pendant 15 min, en le tournant à un angle de 45° à 155 tr/min.
- Transférez le mélange dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et centrifugez à 16 100 x g pendant 2,5 min (à température ambiante).
- Jetez le surnageant et raclez doucement le tube cinq fois sur le sol de la hotte pour remettre la pastille en suspension.
- Lavez la suspension avec 1x PBS quatre fois pour retirer tout le RB. Chaque lavage est suivi d’une remise en suspension de la pastille avec un bref vortex ou un pipetage pour une remise en suspension complète.
- Après le lavage final, ajoutez 1000 μL de PBS. La solution est de couleur rose clair. Transférez 200 μL de la suspension de levure lavée chargée de RB dans chacun des trois puits d’une plaque de 96 puits (en trois exemplaires).
- Positionnez la plaque à 96 puits sur le système d’éclairage photodynamique avec des ampoules LED qui éclairent en vert par le bas. Éteignez les lumières de la pièce pour assurer un éclairage uniforme et éviter les interférences. Activer le système d’éclairage LED pour délivrer la dose PDT de 4,38 J/cm2 sur 2 min ; Assurez-vous que le système est bien aligné avec les puits.
- Après l’irradiation, diluez la suspension de levure dans une plaque à 96 puits. Ajoutez 20 μL de suspension de levure dans un puits contenant 180 μL de PBS, créant ainsi une dilution 10 fois. Répétez l’opération pour les dilutions restantes pour obtenir une plage de 10-1 à 10-5.
- Choisissez quatre facteurs de dilution (p. ex., 10-2 à 10-5) en fonction de l’ajustement de la concentration des cellules de levure.
- Pour chaque facteur de dilution, déposer 3 gouttes (20 μL chacune) par quadrant sur des plaques de gélose YPD.
- Une fois la suspension de levure complètement absorbée, environ 10 min par les plaques de gélose, inverser et incuber pendant une nuit à 37 °C.
- Définir T0 comme le C . glabrata parental témoin sans traitement PDT. Préparez les champignons T0 dans la phase de croissance logarithmique comme décrit ci-dessus et exposez-les à une lumière verte de 4,38 J/cm2 en présence de 0,2% de RB. Cette condition PDT inhibe constamment 3 à 3,5 log de croissance fongique.
- Désignez les champignons survivants par T1 et exposez-les à nouveau à la même dose de PDT après qu’ils aient été expansés in vitro jusqu’à une phase de croissance logarithmique. Les champignons qui ont survécu après la deuxième PDT sont notés T2 et ainsi de suite.
- Le lendemain, choisissez des quadrants avec un nombre de colonies compris entre 5 et 80. Comptez le nombre de colonies dans chaque quadrant et calculez le titre à l’aide de la formule suivante : Unité formant colonies (UFC)/mL = Nombre de colonies (moyenne de triples) × Facteur de dilution × 50.
- Effectuez la coloration TTC (voir étape 3). Balayez la plaque comme décrit précédemment (étape 2.2).
- Préparez le système aPDT.
3. Analyse de la fonction mitochondriale (test de coloration TCC)
REMARQUE : TTC est un indicateur redox et un accepteur d’électrons. Il devient rouge lorsque les composés blancs sont brisés par les électrons11. Notez que toutes les cellules ne forment pas nécessairement des colonies visibles dans les 24 heures suivant la culture sur une plaque de gélose. Les colonies avec des mitochondries fonctionnelles deviennent rouges, tandis que celles avec des mitochondries non fonctionnelles restent blanches. Cela permet de différencier les colonies ayant des fonctionnalités mitochondriales différentes.
- Après le traitement, diluez les suspensions de Candida sur des plaques de gélose YPD en fonction de la densité cellulaire souhaitée pour obtenir des colonies distinctes pour une visualisation et une coloration faciles.
- Après 24 h de croissance à 37 °C, des colonies visibles se forment à partir d’une seule cellule. Pipette 20 μL de 20% TTC directement sur le centre de chaque colonie.
- Après absorption complète, environ 10 min de TTC par les colonies, incuber à 37 °C pendant 30-40 min.
4. Cinétique de croissance de C. glabrata normale et petite
REMARQUE : Trois souches de levures ont été comparées : C. glabrata C2-1000907 T0 (isolat clinique sans traitement PDT), T3n (C. glabrata C2-1000907 après 3 RB-PDT consécutives présentant des colonies d’un diamètre moyen de 1,5 ± 0,8 mm similaires aux cellules parentales), et T3p (petites colonies de C. glabrata C2-1000907 après 3 RB-PDT consécutives).
- Ajuster la suspension de cellules de levure dans un milieu YPD à une DO600 de 0,1 (5 × 106 cellules/mL) dans un tube de 3 mL.
- Mesurez automatiquement la DO600 de la culture statique toutes les 20 min à l’aide du lecteur de microplaques multimode (voir tableau des matériaux) pendant 24 h.
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Representative Results
Les données sont présentées comme la moyenne avec ±'erreur type et ont été obtenues à partir de trois expériences indépendantes, avec au moins des triples dans chaque groupe. Les données expérimentales, y compris le dénombrement des colonies, les mesures de DO600 et les résultats de coloration TTC, ont été représentées graphiquement et analysées statistiquement à l’aide d’un logiciel graphique et statistique (voir la Table des matériaux). L’ANOVA à un facteur ou le test t a été utilisé pour analyser les données, et une valeur p <0,05 a été considérée comme significative. Le balayage a été effectué avec un scanner optique couleur 48 bits à une résolution de 1200 dpi, et les mesures ultérieures des diamètres de la colonie ont été effectuées à l’aide du logiciel ImageJ.
Comme le montrent les courbes de croissance de la figure 2, les petits mutants de C. glabrata C2-1000907 (T3p) ont montré une croissance plus lente que les champignons parentaux non traités de taille normale (T0). Lorsque C. glabrata a été mélangé avec 0,2 % de RB pendant 15 min et exposé à une lumière verte de 4,38 J/cm2 (traitement PDT), le titre des champignons a diminué de 107,5 UFC/mL à 104,5 UFC/mL (au moins 3 logs, figure 3) par rapport au groupe témoin (RB uniquement), qui avait une densité cellulaire d’environ 107 UFC/mL. De plus, après les aPDTs, de petites colonies ont été observées. Ces petites colonies avaient une taille moyenne de 0,4 mm ± 0,25 mm au lieu de la taille habituelle de 1,5 mm ± 0,8 mm (figure 4A). Les colonies de petite taille avec un dysfonctionnement mitochondrial peuvent être identifiées par leur taille et leur couleur après coloration avec 20% de TTC. Les petites colonies qui ont conservé une couleur blanche (figure 3B, flèches blanches) ont présenté un dysfonctionnement mitochondrial, tandis que certaines colonies plus petites de couleur rouge et des colonies de taille normale ont conservé une fonction mitochondriale normale (figure 4B). L’agent intercalateur traditionnel de l’ADN, le bromure d’éthidium (Figure 4C) et le fluconazole (Figure 4D) peuvent induire efficacement de petits mutants de Candida. La diffusion sur disque est une méthode simple pour définir la sensibilité aux médicaments chez les champignons. Sur la figure 4D, une zone circulaire claire de non-croissance entourait le disque de fluconazole contenant 25 μg de fluconazole dans la culture T0 (sans TPD), ce qui indique une moindre résistance aux médicaments chez ce champignon parental. Néanmoins, la souche C2-1000907 de C. glabrata est toujours définie comme une souche résistante par sa concentration minimale d’inhibition envers le fluconazole (données non présentées) et le diamètre de la zone claire. Dans la culture T3, de nombreuses petites colonies se sont formées près du disque (flèche, panneau inférieur), suggérant une résistance aux médicaments après trois traitements PDT répétés.
Figure 1 : Structure moléculaire de la rose Bengal (RB). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Courbes de croissance de C. glabrata C2-1000907 24 h après une RB-PDT répétitive. Les courbes de croissance ont été comparées pour trois souches : C. glabrata C2-1000907 T0 (cellules parentales naïves), T3n (colonies de taille normale après 3 traitements répétés) et T3p (petites colonies après 3 traitements répétés). Comparativement à T0 et T3n, les colonies de T3p présentaient un taux de croissance significativement plus lent (n = 3, p < 0,05). Toutes les cellules sont cultivées dans un milieu YPD. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Inhibition de la croissance de C. glabrata C2-1000907 après une aPDT. Un seul traitement aPDT avec une dose légère de 4,38 J/cm² et 0,2 % de RB a inhibé significativement la croissance de C. glabrata C2-1000907 de 3 log par rapport au témoin naïf (p < 0,0001, test t non apparié). Les barres d’erreur représentent la moyenne ± MEB, les données sont regroupées à partir de 3 expériences indépendantes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Analyse de la dysfonction mitochondriale à l’aide d’une coloration au chlorure de triphényltétrazolium (TCC). (A) C. glabrata C2-1000907, 24 h après le traitement aPDT (0,2 % RB, 4,38 J/cm² de lumière verte), a montré une distribution bimodale de la taille des colonies, avec de grandes (1,5 mm ± 0,8 mm) et de petites (petites) colonies (0,4 mm ± 0,25 mm). (B) La coloration TCC a révélé que les grandes colonies étaient fonctionnelles, car elles devenaient rouges, tandis que les petites colonies étaient non fonctionnelles, car elles restaient blanches. (C) De petites colonies ont également été induites par le bromure d’éthidium (100 μg/mL pendant 30 à 40 min) et (D) par le traitement au fluconazole (25 μg/mL). Une zone circulaire claire de non-croissance entourait le disque de fluconazole contenant 25 μg de fluconazole dans la culture T0 (sans TPD), indiquant une sensibilité. Dans la culture T3, de nombreuses petites colonies se sont formées près du disque (flèche, panneau inférieur), suggérant une résistance aux médicaments après trois traitements PDT répétés. Barres d’échelle : 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figurine.
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Discussion
Cette étude révèle que la PDT est la première méthode rapportée pour induire la formation de petites colonies chez Candida, surpassant les effets établis du bromure d’éthidium et du fluconazole. Cette nouvelle observation nécessite une exploration plus approfondie pour démêler ses implications à la fois pour l’éradication fongique en diminuant la virulence et l’émergence de mécanismes de résistance.
La PDT médiée par RB inhibe efficacement la croissance de C. glabrata, suggérant une approche de traitement alternative potentielle pour les infections à Candida. En tant que photosensibilisant activé par la lumière, RB produit de l’oxygène singulet et des espèces réactives de l’oxygène (ROS) lorsqu’il est exposé à une longueur d’onde spécifique. Ce stress oxydatif endommage les composants cellulaires essentiels tels que les lipides, les protéines et les acides nucléiques13, entraînant un dysfonctionnement mitochondrial, comme le montre la présente étude. Il est donc difficile pour Candida de développer une résistance par le biais des mécanismes conventionnels observés avec les médicaments antifongiques standard.
Les trois souches de levure utilisées dans cette étude, T0, T3n et T3p, présentent des modèles de croissance distincts. La T0 n’est pas traitée, tandis que la T3n et la T3p subissent trois fois la RB-PDT. T3n présente des colonies de taille normale, tandis que T3p présente de petites colonies. La croissance plus lente des petites colonies peut indiquer des altérations de l’énergie cellulaire et du métabolisme. Le petit phénotype, souvent associé à un dysfonctionnement mitochondrial4, pourrait entraîner une altération de la respiration aérobie, influençant par conséquent la cinétique de croissance globale. L’altération de la respiration aérobie dans les petites colonies peut affecter leur virulence, leur sensibilité aux médicaments ou leur capacité à persister dans différents environnements. Ce lien a des implications cliniques potentielles et ouvre la voie à de futures orientations de recherche.
Le bromure d’éthidium, un agent d’intercalation de l’ADN, inhibe la synthèse de l’ADN mitochondrial et dégrade l’ADN mitochondrial existant, transformant Candida en petites colonies avec un dysfonctionnement mitochondrial14. Le fluconazole, couramment utilisé pour traiter les infections à Candida, peut induire une résistance aux médicaments et le développement de petites colonies chez C. glabrata6. Les petits mutants peuvent présenter une résistance aux médicaments azolés par l’activation du facteur de transcription PDR1 et sa régulation des gènes CDR1 et CDR215. De plus, en raison de la perte partielle ou totale de l’ADN mitochondrial, la fonction mitochondriale est compromise16.
La PDT a démontré son efficacité dans la réduction de la virulence bactérienne17, l’induction de la sensibilité aux antibiotiques18 et la réduction de la formation de biofilm19 chez les bactéries. Les études sur la PDT contre les infections fongiques sont limitéesà 20. Cette découverte soulève des questions intrigantes sur la façon dont la RB-PDT affecte les mitochondries chez C. glabrata. Pour bien comprendre l’impact de la RB-PDT sur les cellules de levure, il est crucial de comprendre les mécanismes moléculaires à l’origine des variations de croissance. Cependant, les petits mutants induits par la PDT sont actuellement sous-étudiés, et leurs fondements mécanistes détaillés restent incertains. Des recherches plus approfondies sont nécessaires pour déterminer s’il existe des différences entre les petites colonies créées par diverses méthodes. Comprendre comment les petites espèces de Candida se forment est important pour étudier la relation entre la fonction mitochondriale et la pathogénicité. De plus, les petits mutants peuvent servir de modèle pour explorer les mécanismes de résistance aux médicaments antifongiques.
La présente étude, bien qu’elle fournisse des informations précieuses sur les effets de la TPD médiée par RB sur C. glabrata et l’émergence de petites colonies, présente certaines limites qui doivent être prises en compte. Tout d’abord, l’étude s’est principalement concentrée sur les expériences in vitro, et l’application de ces résultats aux contextes cliniques justifie une enquête plus approfondie. De plus, les mécanismes moléculaires spécifiques sous-jacents à la formation de petites colonies après la RB-PDT et leurs implications potentielles pour la résistance aux médicaments antifongiques nécessitent une exploration plus approfondie. De plus, alors que l’étude comparait les modèles de croissance de différentes souches de levure, des analyses moléculaires et génétiques supplémentaires pourraient fournir une compréhension plus profonde des changements métaboliques et génétiques associés à la formation de petites colonies.
De plus, la variabilité potentielle de la réponse à la RB-PDT entre différents isolats cliniques de C. glabrata n’a pas été abordée dans cette étude, ce qui souligne la nécessité d’investigations plus larges spécifiques à la souche. Les études futures portant sur ces limites seront cruciales pour une compréhension plus complète des implications de la PDT médiée par RB et de l’émergence de petites colonies dans le contexte des stratégies de traitement antifongique.
En résumé, cette étude révèle que l’aPDT induit de petits mutants de C. glabrata (C2-1000907) avec une fonction mitochondriale altérée. Ce mécanisme unique pourrait offrir une nouvelle méthode pour les études antifongiques. Le mécanisme d’action précis sous-jacent aux petites colonies induites par la PDT reste à élucider, et l’exploration des différences potentielles par rapport à d’autres méthodes sera cruciale pour optimiser les stratégies thérapeutiques.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ce travail a reçu un financement du ministère de la Science et de la Technologie de Taïwan [MOST 110-2314-B-006-086-MY3], de l’Université nationale Cheng Kung [K111-B094], [K111-B095], de l’Hôpital universitaire national Cheng Kung, Taïwan [NCKUH-11204031], [NCKUMCS2022057].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm filter | Merck, Taipei, Taiwan | Millex, SLGVR33RS | |
| 1.5 mL microfuge tube | Neptune, San Diego, USA | #3745 | |
| 20% Triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma-Aldrich, MO, USA | T8877 | |
| 5 mL polypropylene round bottom tube | Corning, AZ, USA | 352059 | |
| 5 mL round-bottom tube with cell strainer cap | Corning, AZ, USA | Falcon, #352235 | |
| 96-well plate | Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan | #16196 | |
| Agar | BRS, Tainan, Taiwan | AG012 | |
| Blank disk | Advantec, Tokyo, Japan | 49005040 | |
| Centrifuge | Eppendorf, UK | 5415R | |
| Ethidium bromide solution | Sigma-Aldrich, MO, USA | E1510 | |
| Fluconazole, 2 mg/mL | Pfizer, NY, USA | BC18790248 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 7.0 | |
| Green light emitting diode (LED) strip | Nanyi electronics Co.,Ltd, Tainan, Taiwan | 5050 | Excitation wave: 500~550 nm |
| Low Temperature. shake Incubators | Yihder, Taipei, Taiwan | LM-570D (R) | |
| Mouth care cotton swabs | Good Verita Enterprise, Taipei, Taiwan | 161357 | |
| Muller Hinton II agar | BD biosciences, California, USA | 211438 | |
| Multimode microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax i3x | |
| OD600 spectrophotometer | Biochrom, London, UK | Ultrospec 10 | |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich, USA | 330000 | stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C |
| Sterilized glass tube | Sunmei, Tainan, Taiwan | AK45048-16100 | |
| Yeast Extract Peptone Dextrose Medium | HIMEDIA, India | M1363 |
References
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