Summary
Dit protocol beschrijft de omgekeerde emulsiemethode die wordt gebruikt om een celvrije expressie (CFE) -systeem in te kapselen in een gigantisch unilamellair blaasje (GUV) voor het onderzoek naar de synthese en incorporatie van een modelmembraaneiwit in de lipidedubbellaag.
Abstract
Celvrije expressie (CFE)-systemen zijn krachtige hulpmiddelen in de synthetische biologie die biomimicry van cellulaire functies zoals biosensing en energieregeneratie in synthetische cellen mogelijk maken. Reconstructie van een breed scala aan cellulaire processen vereist echter een succesvolle reconstructie van membraaneiwitten in het membraan van synthetische cellen. Hoewel de expressie van oplosbare eiwitten meestal succesvol is in gangbare CFE-systemen, is de reconstitutie van membraaneiwitten in lipidedubbellagen van synthetische cellen een uitdaging gebleken. Hier wordt een methode gedemonstreerd voor reconstitutie van een modelmembraaneiwit, bacteriële glutamaatreceptor (GluR0), in gigantische unilamellaire blaasjes (GUV's) als modelsynthetische cellen op basis van inkapseling en incubatie van de CFE-reactie in synthetische cellen. Door gebruik te maken van dit platform wordt het effect aangetoond van het vervangen van het N-terminale signaalpeptide van GluR0 door proteorhodopsine signaalpeptide op succesvolle cotranslationele translocatie van GluR0 in membranen van hybride GUV's. Deze methode biedt een robuuste procedure die celvrije reconstitutie van verschillende membraaneiwitten in synthetische cellen mogelijk maakt.
Introduction
Bottom-up synthetische biologie heeft de afgelopen tien jaar steeds meer belangstelling gekregen als een opkomend veld met tal van potentiële toepassingen in bio-engineering, medicijnafgifte en regeneratieve geneeskunde 1,2. Met name de ontwikkeling van synthetische cellen als hoeksteen van bottom-up synthetische biologie heeft een breed scala aan wetenschappelijke gemeenschappen aangetrokken vanwege de veelbelovende toepassingen van synthetische cellen en hun celachtige fysische en biochemische eigenschappen die in vitro biofysische studies vergemakkelijken 3,4,5,6 . Synthetische cellen worden vaak gemanipuleerd in gigantische unilamellaire blaasjes (GUV's) ter grootte van een cel waarin verschillende biologische processen worden nagebootst. Reconstitutie van celcytoskelet 7,8, lichtafhankelijke energieregeneratie9, cellulaire communicatie10,11 en biosensing12 zijn voorbeelden van inspanningen die zijn geleverd om celachtig gedrag in synthetische cellen te reconstrueren.
Hoewel sommige cellulaire processen afhankelijk zijn van oplosbare eiwitten, maken veel kenmerken van natuurlijke cellen, zoals detectie en communicatie, vaak gebruik van membraaneiwitten, waaronder ionkanalen, receptoren en transporters. Een grote uitdaging bij de ontwikkeling van synthetische cellen is de reconstitutie van membraaneiwitten. Hoewel traditionele methoden voor membraaneiwitreconstitutie in lipidedubbellagen afhankelijk zijn van detergent-gemedieerde zuivering, zijn dergelijke methoden arbeidsintensief, ineffectief voor eiwitten die giftig zijn voor de expressiegastheer, of zijn ze vaak niet geschikt voor membraaneiwitreconstitutie in GUV's13.
Een alternatieve methode voor eiwitexpressie zijn celvrije expressie (CFE) systemen. CFE-systemen zijn een krachtig hulpmiddel geweest in de synthetische biologie dat in vitro expressie van verschillende eiwitten mogelijk maakt met behulp van cellysaat of gezuiverde transcriptie-translatiemachines14. CFE-systemen kunnen ook worden ingekapseld in GUV's, waardoor gecompartimenteerde eiwitsynthesereacties mogelijk zijn die kunnen worden geprogrammeerd voor verschillende toepassingen, zoals de creatie van lichtoogstende synthetische cellen9 of mechanosensitieve biosensoren15,16. Analoog aan recombinante eiwitexpressiemethoden is de expressie van membraaneiwitten een uitdaging in CFE-systemen17. Aggregatie, misvouwing en gebrek aan posttranslationele modificatie in CFE-systemen zijn belangrijke knelpunten die een succesvolle membraaneiwitsynthese met behulp van CFE-systemen in de weg staan. De moeilijkheid van bottom-up membraaneiwitreconstitutie met behulp van CFE-systemen is deels te wijten aan de afwezigheid van een complexe membraaneiwitbiogeneseroute die berust op signaalpeptiden, signaalherkenningsdeeltjes, translocons en chaperonneringsmoleculen. Onlangs hebben meerdere onderzoeken echter gesuggereerd dat de aanwezigheid van vliezige structuren zoals microsomen of liposomen tijdens de translatie een succesvolle membraaneiwitexpressie bevordert 18,19,20,21. Bovendien hebben Eaglesfield et al. en Steinküher et al. ontdekt dat de opname van specifieke hydrofobe domeinen, bekend als signaalpeptiden, in de N-terminus van het membraaneiwit de expressie ervan aanzienlijk kan verbeteren22,23. Al met al suggereren deze studies dat de uitdaging van membraaneiwitreconstitutie in synthetische cellen kan worden overwonnen als de eiwittranslatie plaatsvindt in aanwezigheid van het GUV-membraan en als het juiste N-terminale signaalpeptide wordt gebruikt.
Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het inkapselen van de eiwitsynthese met behulp van recombinante elementen (PURE) CFE-reacties voor membraaneiwitreconstitutie in GUV's. Bacteriële glutamaatreceptor24 (GluR0) wordt geselecteerd als het modelmembraaneiwit en het effect van zijn N-terminale signaalpeptide op zijn membraanreconstitutie wordt bestudeerd. Het effect van proteorhodopsine-signaalpeptide, waarvan door Eaglesfield et al.22 werd aangetoond dat het de efficiëntie van de reconstitutie van membraaneiwitten verbetert, wordt onderzocht door een gemuteerde variant van GluR0 te construeren die wordt aangeduid als PRSP-GluR0 en de expressie en membraanlokalisatie ervan met wildtype GluR0 (hierna WT-GluR0 genoemd) dat zijn oorspronkelijke signaalpeptide herbergt, wordt vergeleken. Dit protocol is gebaseerd op de omgekeerde emulsiemethode25 met aanpassingen die het robuust maken voor CFE-inkapseling. In de gepresenteerde methode worden de CFE-reacties eerst geëmulgeerd met behulp van een lipide-in-olie-oplossing die druppeltjes ter grootte van een micron genereert die het CFE-systeem bevatten en worden gestabiliseerd door de lipidemonolaag. De emulsiedruppels worden vervolgens gelaagd op een olie-waterinterface die verzadigd is met een andere lipide-monolaag. De emulsiedruppels worden vervolgens via middelpuntvliedende kracht over het olie-watergrensvlak gedreven. Door dit proces krijgen de druppels een andere monolaag, waardoor een dubbellaags lipideblaasje ontstaat. De GUV's die de CFE-reactie bevatten, worden vervolgens geïncubeerd, waarbij het membraaneiwit tot expressie wordt gebracht en in het GUV-membraan wordt opgenomen. Hoewel dit protocol is gespecificeerd voor celvrije expressie van GluR0, kan het worden gebruikt voor celvrije synthese van andere membraaneiwitten of verschillende synthetische celtoepassingen zoals cytoskeletreconstitutie of membraanfusiestudies26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De reagentia en apparatuur die voor dit onderzoek zijn gebruikt, zijn opgenomen in de materiaaltabel.
1. Bulk CFE-reacties in aanwezigheid van kleine unilamellaire blaasjes (SUV's)
- SUV voorbereiding
NOTITIE: Deze stap moet worden uitgevoerd in een zuurkast volgens de veiligheidsinstructies voor het werken met chloroform.- Bereid 5 mM 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-fosfocholine (POPC) SUV's in een glazen injectieflacon door 76 μl 25 mg/ml POPC-bouillonoplossing opgelost in chloroform over te brengen.
- Terwijl u de glazen injectieflacon voorzichtig ronddraait, blaast u een zachte stroom argon in de injectieflacon om op de bodem een film van gedroogde lipiden te vormen. Breng vervolgens de glazen injectieflacon over naar een exsiccator met de dop losjes geschroefd om overtollige chloroform te verdampen.
- Bewaar de glazen injectieflacon 1 uur in de exsiccator . Voeg vervolgens 0,5 ml ultrazuiver gedeïoniseerd water toe om de lipidenfilm en de draaikolk gedurende ongeveer 2 minuten op te lossen.
- Zet een mini-extrusieapparaat op door twee filtersteunen in gedeïoniseerd water te weken en ze op elk van de interne membraansteunen te plaatsen. Week vervolgens een polycarbonaatfilter van 100 nm en plaats deze tussen de twee interne membraansteunen die bij elkaar worden gehouden door de buitenmantel van de extruder en de borgmoer. Plaats deze opstelling in de extruderstandaard.
- Spoel twee gasdichte spuiten van 1 ml 3 keer door met ultrazuiver gedeïoniseerd water.
- Plaats het monster van het lipide-watermengsel in een van de gasdichte spuiten van 1 ml en plaats het in het ene uiteinde van de mini-extruder met behulp van de zwenkarmclips om de spuit op zijn plaats te houden. Steek de tweede spuit in het andere uiteinde van de mini-extruder en zorg ervoor dat deze volledig is ingedrukt.
OPMERKING: Wanneer u de spuit laadt met het lipide-watermengsel, zorg er dan voor dat er geen lucht in de spuit zit voordat u deze door de mini-extruder haalt. - Haal het lipide-watermengsel voorzichtig van de originele spuit naar de lege spuit door het mini-extruderapparaat. Herhaal deze stap 11 keer om SUV's te vormen. Breng de SUV's over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
OPMERKING: De SUV-oplossing kan maximaal 2 weken bij 4 °C worden bewaard.
- Assemblage van de CFE-reactie
- Assembleer de CFE-reactie volgens het protocol voor celvrije expressie dat door de fabrikant is verstrekt, met kleine wijzigingen die hieronder worden beschreven.
- Meng 10 μl oplossing 1 (met aminozuren, NTP's, tRNA's en substraten voor enzymen, en de benodigde buffer), 1 μl oplossing 2 (eiwitten in 20% glycerol), 2 μl oplossing 3 (ribosoom (20 μM)), de juiste hoeveelheid DNA die codeert voor oplosbaar sfGFP-sfCherry(1-10)27 (hierna oplosbaar sfGFP genoemd), WT-GluR0-sfGFP of PRSP-GluR0-sfGFP (10-60 ng/1000 basenparen), 1 μL muizen-RNAseremmer en 4 μL 5 mM SUV-oplossing voor membraaneiwitten of 4 μL water voor oplosbare eiwitten.
- Breng het uiteindelijke volume van de reactie op 20 μL door ultrazuiver gedeïoniseerd water toe te voegen.
OPMERKING: Bij de montage van het CFE-systeem moeten alle onderdelen op ijs worden bewaard. Alle materialen zijn temperatuurgevoelig en kunnen degraderen als ze op kamertemperatuur komen.
- Incubatie en monitoring van CFE-reacties
- Breng de CFE-oplossing over naar een conische V-bodemplaat met 96 putjes. Om verdamping tijdens de reactie te voorkomen, dekt u de plaat af met een afdichtingsfolie.
- Incubeer de plaat bij 37 °C in een plaatlezer gedurende 4-5 uur terwijl u de CFE-reactie bewaakt door het GFP-signaal te meten met een versterking van 100 bij 488 nm/528 nm excitatie-/emissiegolflengten om de 2 minuten.
2. CFE-reacties ingekapseld in GUV's
- Bereiding van GUV buitenste bufferoplossing
- Meng in een microcentrifugebuisje van 1,5 ml 1,5 μl 1 M spermidine, 37,5 μl 100 mM ATP, 25 μl 100 mM GTP, 12,5 μl 100 mM CTP, 12,5 μL 100 mM UTP, 25 μL 1 M creatinefosfaat, 18 μL 1 M magnesiumacetaat, 93,33 μL 3 M kaliumglutamaat, 50 μL 1 M HEPES KOH (pH 7,4), 1,15 μL 332 mM folinezuur, 100 μL 2 M glucose en 50 μL uit bouillonoplossing van 6 mM mengsel van elk van de 20 aminozuren (bereid volgens het protocol beschreven door Sun et al.28).
- Breng het uiteindelijke volume van de oplossing op 1 ml door ultragezuiverd gedeïoniseerd water toe te voegen.
NOTITIE: Alle onderdelen moeten op ijs worden bewaard. Voeg het aminozuurmengsel aan het einde toe om uitputting van aminozuren te voorkomen28. De oplossing kan worden gealiquoteerd in aliquots van 330 μl en tot gebruik worden bewaard bij -20 °C.
- Bereiding van het lipide-in-oliemengsel
OPMERKING: deze stap moet worden uitgevoerd in een zuurkast volgens de veiligheidsinstructies voor het werken met chloroform.- Meng in een zuurkast 17,3 μl 25 mg/ml POPC-bouillonoplossing en 1,08 μl 50 mg/ml poly(butadieen)-b-poly(ethyleenoxide) (PEO-b-PBD) copolymeer in een glazen injectieflacon van 15 ml.
OPMERKING: De uiteindelijke lipide-in-olie-oplossing bevat 0,5 mM lipide met respectievelijk 95% en 5% POPC en PEO-b-PBD. PEO-b-PBD werd gebruikt om de stabiliteit van het membraan tijdens eiwitexpressie te verbeteren, maar werd op een lage molaire verhouding gehouden om de neiging van het copolymeer om te aggregeren tot micellen die gescheiden zijn van lipidemoleculen te verminderen29,30. - Blaas voorzichtig een zachte stroom argongas in de glazen injectieflacon terwijl u de injectieflacon draait om de chloroform te verdampen.
- Pipetteer 1,2 ml lichte minerale olie in de glazen injectieflacon van 15 ml met de gedroogde lipiden.
- Meng de lipiden en olie door 10-20 s op maximale snelheid te vortexen. De opgeloste lipide-copolymeermix ziet er troebel uit.
- Om ervoor te zorgen dat alle mogelijke lipideaggregaten in de olie volledig zijn opgelost en door de olie zijn gedispergeerd, plaatst u de glazen injectieflacon gedurende 20 minuten in een oven op ongeveer 50 °C voordat u nog eens 10-20 s op maximale snelheid vortexeert.
- Meng in een zuurkast 17,3 μl 25 mg/ml POPC-bouillonoplossing en 1,08 μl 50 mg/ml poly(butadieen)-b-poly(ethyleenoxide) (PEO-b-PBD) copolymeer in een glazen injectieflacon van 15 ml.
- Assemblage en inkapseling van de CFE-reactie (figuur 1 vat de volgende stappen samen).
- Bereid 300 μl van de GUV-buitenoplossing in een microcentrifugebuisje van 1,5 ml door 270 μl CFE-buitenbufferoplossing bereid in stap 2.1, 15 μl 5 M NaCl en 15 μl 4,5 M KCl te mengen.
OPMERKING: Voeg bij deze stap 0,45 μl 1 M 1,4-dithiothreitol (DTT) toe aan de GUV-buitenoplossing. Het doel van het toevoegen van NaCl en KCl is om de osmolaliteit van de buitenoplossing aan te passen aan deze af te stemmen op de binnenste CFE-oplossing. Het exacte volume van NaCl en KCl is afhankelijk van de gewenste osmolaliteitsaanpassing. Men kan NaCl of KCl of beide toevoegen om de osmolaliteit aan te passen. - Pipetteer voorzichtig 300 μL lipide-in-oliemengsel bovenop de GUV-buitenoplossing.
OPMERKING: Bij het toevoegen van de lipide-oliemix is het belangrijk dat de olie zich niet vermengt met de waterige buitenoplossing. Na de toevoeging moet er een zichtbaar raakvlak zijn tussen het lipide-in-oliemengsel en de GUV-buitenoplossing. - Incubeer het olie-watergrensvlak bij kamertemperatuur gedurende 2 uur om de lipide-monolaag te laten vormen en stabiliseren op het grensvlak.
- Volg ondertussen paragraaf 1.2.1 om een CFE-reactie samen te stellen die het plasmide-DNA bevat dat codeert voor de membraaneiwitvarianten of oplosbaar GFP. Vervang de 4 μL 5 mM SUV-oplossing of water door 4 μL 1 M sucrose. Deze reactie zal de GUV inwendige oplossing zijn.
OPMERKING: Een osmometer werd gebruikt om de osmolaliteit van de binnen- en buitenoplossingen te meten. De osmolaliteit van de buitenoplossing werd vervolgens dienovereenkomstig aangepast door toevoeging van NaCl of water. De osmolaliteit van de CFE-reactie ligt doorgaans rond de 1600 mOsm/Kg. Door sucrose aan de reactie toe te voegen, wordt de dichtheid van de inwendige oplossing verhoogd, waardoor de blaasjes tijdens de centrifugatiestap over het olie-watergrensvlak kunnen bewegen. Een alternatief voor sucrose is de Opti-Prep dichtheidsgradiëntoplossing. - Voeg 600 μL lipide-oliemengsel toe aan de microcentrifugebuis met de CFE-reactie en pipetteer krachtig op en neer gedurende ~1 minuut om de reactie in lipide-in-olie-oplossing te emulgeren en de lipide-monolaag rond synthetische cellen te vormen.
OPMERKING: De uiteindelijke oplossing mag geen luchtbellen bevatten en moet er ondoorzichtig uitzien. - Pipeteer de emulsie van de binnenoplossing voorzichtig op de olielaag in de microcentrifugebuis van 1,5 ml waarin de olie-waterinterface is ingesteld.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u de interface niet verstoort of destabiliseert. - Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 2.000 x g bij 4 °C.
OPMERKING: De centrifugatiesnelheid is geoptimaliseerd voor dit protocol. Adir et al.31 rapporteerden een andere centrifugatiesnelheid. - Zodra het centrifugeren is voltooid, verwijdert u voorzichtig de overtollige olie en de buitenoplossing uit de microcentrifugebuis met behulp van een pipettor. Verwijder de buitenoplossing tot het resterende volume ongeveer 100 μl is.
OPMERKING: Een pellet GUV's is meestal zichtbaar op de bodem van de microcentrifugebuis. Een gebrek aan een zichtbare korrel betekent echter niet noodzakelijkerwijs geen GUV-opbrengst. In plaats van een pipettor te gebruiken, kan de overtollige olie bovenop de buitenste oplossing worden verwijderd door aspiratie. Het is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de lipide-in-olie-oplossing volledig wordt verwijderd. Olieverontreiniging in de GUV-oplossing kan afbeeldingen van lage kwaliteit veroorzaken. - Resuspendeer de GUV-pellet in de resterende 100 μL-oplossing door voorzichtig op en neer te pipetteren. Breng vervolgens de GUV-oplossing over naar een schone, doorzichtige vlakke bodemplaat met 96 putjes om te incuberen.
- Bereid 300 μl van de GUV-buitenoplossing in een microcentrifugebuisje van 1,5 ml door 270 μl CFE-buitenbufferoplossing bereid in stap 2.1, 15 μl 5 M NaCl en 15 μl 4,5 M KCl te mengen.
3. Incubatie en beeldvorming van ingekapselde CFE-reacties
- Dek de plaat af met een afdichtingsfolie om verdamping te voorkomen. Incubeer de plaat 5-6 uur bij 37 °C. Men kan een plaatlezer gebruiken en stap 1.3.2 volgen om de plaatlezer voor te bereiden op de incubatiestap.
- Zodra de incubatie voorbij is, plaatst u de plaat met 96 putjes op de beeldvormingstafel van een omgekeerde microscoop die is uitgerust met een EMCCD-camera (of een sCMOS-camera), DAQ-MX-gestuurde laser (of een geïntegreerd lasercombinersysteem) en een CSU-X1 draaiende schijf confocaal (of een confocale laserscanning). Stel u scherp op elke ROI die GUV's bevat en leg beelden vast met een excitatiegolflengte van 488 nm met behulp van een Plan-Apochromat 60 x/1.4 NA-objectief.
- Sla afbeeldingen van GUV's op in .tiff formaat.
- Open de afbeeldingen in een beeldverwerkingssoftware (bijv. ImageJ of Fiji). Open het instellingenpaneel voor helderheid/contrast . Pas de helderheid en het contrast aan de juiste instellingen aan die fluorescerende eiwitten zichtbaar maken.
- Als het doel is om de signaalintensiteit van verschillende tot expressie gebrachte eiwitten te vergelijken, stapel dan eerst individuele afbeeldingen van GUV's die verschillende eiwitten bevatten met behulp van het deelvenster Afbeeldingen om te stapelen onder het submenu Afbeelding > stapels . Pas vervolgens de helderheid en het contrast van alle afbeeldingen aan met behulp van het paneel Helderheid/contrast .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voorafgaand aan de inkapseling van de CFE-reacties werden twee varianten van GluR0-sfGFP die native- en proteorhodopsine-signaalpeptiden herbergden (signaalpeptidesequenties worden weergegeven in aanvullende tabel 1), en het oplosbare sfGFP werden individueel tot expressie gebracht in bulkreacties, en hun expressie werd gecontroleerd door het sfGFP-signaal te detecteren met behulp van een plaatlezer (Figuur 2A). Membraaneiwitten werden tot expressie gebracht in de afwezigheid of aanwezigheid van 100 nm SUV's. Bovendien werden met behulp van een kalibratiecurve die het sfGFP-signaal correleert met de concentratie ervan (aanvullende figuur 1), de concentraties van gesynthetiseerde eiwitten geschat (aanvullende tabel 2). Het is duidelijk dat oplosbaar sfGFP de hoogste expressie had van alle drie de eiwitten, wat suggereert dat de expressie van membraaneiwitten een belasting vormt voor het CFE-systeem, waardoor de reactie wordt vertraagd en de opbrengst ervan wordt verlaagd. Bovendien vertoonden reacties die membraaneiwitten tot expressie brachten in de aanwezigheid van SUV's gemiddeld een hoger sfGFP-signaal in vergelijking met reacties zonder SUV's. Deze observatie komt overeen met de bevindingen van Steinküher et al., die aantoonden dat de expressie van membraaneiwitten het vermogen van de CFE-systemen om eiwitten te produceren vermindert. Desalniettemin, gezien de succesvolle demonstratie van eiwitexpressie in bulk CFE-reacties, kan men redeneren dat ingekapselde CFE ook eiwitten in GUV's zal synthetiseren.
Vervolgens werden individuele CFE-reacties ingekapseld in GUV's met behulp van de omgekeerde emulsiemethode om varianten van GluR0 tot expressie te brengen, namelijk WT-GluR0, PRSP-GluR0 en oplosbaar sfGFP. Terwijl WT-GluR0, dat GluR0 native signaalpeptide herbergt, een uitstekende expressie en membraanlokalisatie vertoonde (Figuur 2B, linkerpaneel), vertoonde zijn tegenhanger, PRSP-GluR0, die proteorhodopsine N-terminaal signaalpeptide heeft, geen vergelijkbare sterke membraanlokalisatie. PRSP-GluR0 bleek vatbaarder te zijn voor aggregatie en puntvorming (Figuur 2B, middelste paneel). Zoals verwacht werd oplosbaar sfGFP tot expressie gebracht in GUV's en bleef het in het GUV-lumen (Figuur 2B, rechterpaneel; zie aanvullende figuur 2 voor afbeeldingen van cohorten van GUV's).
Figuur 1: Experimentele stappen van omgekeerde emulsie. (1) Stap 2.3.1 tot en met stap 2.3.3 van het protocol worden gevisualiseerd om de assemblage van de lipide-monolaag op het grensvlak van het lipide-oliemengsel en de buitenste bufferoplossing te demonstreren. (2) Hier wordt de visualisatie van stap 2.3.5 van het protocol getoond om de vorming van de lipidemonolaag rond geëmulgeerde druppeltjes weer te geven die de binnenste CFE-oplossing inkapselen. (3) Stap 2.3.6 van het protocol toont de toevoeging van de monolaag GUV's aan de microcentrifugebuis met de lipide-monolaag op het grensvlak van een lipide-oliemengsel en een buitenste bufferoplossing. (4) Hier is stap 2.3.7 afgebeeld, waarbij centrifugeren leidt tot de vorming van een GUV-pellet in de buitenoplossing. (5) Hier wordt stap 2.3.8 getoond, die het proces aangeeft van het verwijderen van het overtollige lipide-in-oliemengsel en de buitenoplossing. (6) Ten slotte is hier stap 2.3.9 afgebeeld, waarbij de GUV-pellet opnieuw wordt gesuspendeerd in de buitenoplossing en de GUV's klaar zijn voor incubatie, gevolgd door beeldvorming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Eiwitexpressie in bulk CFE-reacties en in GUV's die CFE-reacties inkapselen. (A) Fluorescentie-uitlezingen van individuele bulk CFE-reacties die WT-GluR0-sfGFP, PRSP-GluR0-sfGFP en oplosbaar sfGFP tot expressie brengen. De oplosbare sfGFP-grafiek geeft het signaal weer van een reactie van 2,5 μl (standaard reactievolume is 20 μl) om oververzadiging van de metingen van de plaatlezer te voorkomen. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± S.D., n = 3. (B) Links: Een representatief confocaal beeld van een GUV-inkapselende CFE-reactie die WT-GluR0-sfGFP tot expressie brengt. Midden: Een representatief confocaal beeld van GUV's die de CFE-reactie inkapselen die PRSP-GluR0-sfGFP tot expressie brengt. Rechts: Een representatief confocaal beeld van een GUV-inkapselende CFE-reactie die oplosbaar sfGFP tot expressie brengt. Schaal balken: 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: De sfGFP-signaalkalibratiecurve en de bijbehorende lineaire regressieanalyse. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Representatief confocaal beeld van cohorten GUV's die (links) WT-GluR0-sfGFP, (midden) PRSP-GluR0-sfGFP en (rechts) oplosbaar sfGFP tot expressie brengen. Schaalbalk: 10 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 1: De aminozuursequentie van wildtype en proteorhodopsine signaalpeptiden. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 2: De concentratie van gesynthetiseerde eiwitten in bulk CFE-reacties. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vrijwel elk cellulair proces dat afhankelijk is van de overdracht van moleculen of informatie over het celmembraan, zoals celsignalering of celexcitatie, vereist membraaneiwitten. Zo is de reconstitutie van membraaneiwitten het belangrijkste knelpunt geworden bij het realiseren van verschillende synthetische celontwerpen voor verschillende toepassingen. Traditionele detergent-gemedieerde reconstitutie van membraaneiwitten in biologische membranen vereist GUV-generatiemethoden zoals zachte zwelling of elektrovorming. Zwellingsbenaderingen produceren meestal kleine blaasjes, en de elektroformatieopbrengst daalt aanzienlijk wanneer gecompliceerde oplossingen, wat vaak het geval is bij het genereren van synthetische cellen, worden ingekapseld32. Bovendien lossen detergenten het membraaneiwit op, en hun verwijdering tijdens het reconstitutieproces kan ervoor zorgen dat het eiwit verkeerd wordt gevouwen33,34. Aan de andere kant is de hier gepresenteerde benadering gebaseerd op de cotranslationele opname van het membraaneiwit in de lipidedubbellaag, die meer lijkt op de natuurlijke eiwitbiogeneseroute in cellen22.
Vanuit technisch oogpunt is het gepresenteerde protocol voordelig ten opzichte van andere gangbare inkapselingsmethoden, zoals elektroformatie en continue druppelinterface-overstekende inkapseling 7,8,35,36 (cDICE), voor eenvoudigere implementatie, aangezien de enige laboratoriumapparatuur die nodig is voor het genereren van GUV een centrifuge is. In tegenstelling tot elektroformatie maakt de omgekeerde emulsiemethode het mogelijk om verschillende combinaties van moleculen met verschillende concentraties in te kapselen. Bovendien genereert deze aanpak, in vergelijking met de oorspronkelijke omgekeerde emulsietechniek25, stabielere GUV's die geschikt zijn voor het inkapselen van CFE-lysaten of PURE-systemen. De hogere GUV-stabiliteit is te danken aan de aanwezigheid van diblock-copolymeer in de samenstelling van GUV-membraan37 en aan de lange incubatie van de olie-waterinterface waardoor de interface verzadigd kan zijn met lipidemoleculen. Ten slotte vereist het hier gepresenteerde protocol, in tegenstelling tot microfluïdische benaderingen, geen kleine kanalen en slangen. Daarom kan de CFE-reactie worden ingekapseld zodra deze is gemonteerd, en de kortere tijd van GUV-assemblage door gebrek aan stroming en mogelijke verstoppingen voorkomt een voortijdige start van de CFE-reactie. Hoewel de demonstratie van membraaneiwitexpressie in dit protocol exclusief is voor PUREfrex-reacties, kan men deze methode uitbreiden om eiwitten te synthetiseren met behulp van verschillende beschikbare CFE-systemen, zoals op lysaat gebaseerde bacteriële of zoogdier-CFE-systemen.
De hier gepresenteerde benadering heeft beperkingen die worden veroorzaakt door de olie-afhankelijke aard van het GUV-vormingsproces en de bedoeling om stabiele GUV's te hebben. Deze aanpak is doorgaans langer in vergelijking met andere methoden, zoals cDICE of microfluïdica, vanwege de lange incubatietijd van de olie-waterinterface die nodig is voor interfacestabilisatie en hoge GUV-opbrengst. Bovendien is de lipidensamenstelling voornamelijk beperkt tot POPC met kleine doses van andere lipiden of blokcopolymeren, terwijl andere methoden, zoals elektrovorming, meer geschikt zijn voor de opname van lipiden met verschillende fysische en chemische eigenschappen. Hoewel de samenstelling van het GUV-membraan in deze methode een mengsel is van POPC en PBD-PEO om de CFE-opbrengst te maximaliseren, kunnen mogelijke variaties in de samenstelling van het GUV-membraan worden getest. Verdere optimalisatie van de parameters kan echter nodig zijn voor andere membraaneiwitten. Aangezien de druppelemulgering plaatsvindt door middel van handmatig pipetteren, zijn de GUV's die via deze methode worden gegenereerd polydisperse en vrij heterogeen van grootte. Verder kan het feit dat lipiden in de organische fase worden opgelost af en toe een laagje olie tussen de twee blaadjes van het GUV-membraan veroorzaken of de beeldvormingskamer besmetten met olie die schadelijk kan zijn voor de beeldkwaliteit. Een mogelijke oplossing voor de uitdaging van restolie is om minerale olie te vervangen door een vluchtig organisch oplosmiddel, zoals diethylether, zoals aangetoond door Tsumoto et al.38, om te vertrouwen op verdamping van oplosmiddelen samen met centrifugatie tijdens GUV-vorming.
Hoewel er in dit werk geen demonstratie is van de kanaalfunctie, geïnspireerd door eerdere tests die werden gebruikt voor het onderzoeken van gereconstitueerde mechano- of lichtgevoelige kanaalfunctionaliteit, wordt een op fluorescentiemicroscopie gebaseerde test geschetst. Naar verluidt verhoogt de opening van het GluR0-kanaal de membraangeleidbaarheid voor K+- ionen24. Omdat CFE-reacties al een hoge concentratie K+ bevatten, zullen typische kaliumindicatoren niet geschikt zijn om de kanaalfunctionaliteit te beoordelen. Omdat kaliuminstroom echter de membraanpotentiaal verandert, kunnen gevoelige membraanpotentiaalindicatoren zoals DiBAC4(3)22 of BeRST 139 GluR0-activiteit rapporteren in aanwezigheid van glutamaat.
Succesvolle reconstitutie van membraaneiwitten in synthetische cellen opent tal van mogelijkheden voor het creëren van synthetische cellen met ongekende vermogens die natuurlijke cellen beter nabootsen. Een actueel groot nadeel van synthetische cellen is hun onvermogen om energie te reproduceren en te recyclen. Met licht- en chemicaliënafhankelijke energieregeneratieschema's die sterk afhankelijk zijn van membraaneiwitten, kan men zich echter duurzame synthetische cellen voorstellen40. Het gebruik van CFE-systemen maakt de reconstitutie mogelijk van meerdere membraaneiwitten die gezamenlijk bepaalde taken kunnen uitvoeren. Bijvoorbeeld, reconstructie van een ligand-gated ionkanaal vergelijkbaar met GluR0 dat hier wordt beschreven, samen met verschillende spanningsafhankelijke ionkanalen, kan leiden tot de constructie van een prikkelbare neuron-achtige synthetische cel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
APL erkent de steun van de National Science Foundation (EF1935265), de National Institutes of Health (R01-EB030031 en R21-AR080363) en het Army Research Office (80523-BB)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 nm polycarbonate filter | STERLITECH | 1270193 | |
| 96 Well Clear Bottom Plate | ThermoFisher Scientific | 165305 | |
| BioTek Synergy H1M Hybrid Multi-Mode Reader | Agilent | 11-120-533 | |
| Creatine phosphate | Millipore Sigma | 10621714001 | |
| CSU-X1 Confocal Scanner Unit | Yokogawa | CSU-X1 | |
| Density gradient medium (Optiprep) | Millipore Sigma | D1556 | Optional to switch with sucrose in inner solution |
| Filter supports | Avanti | 610014 | |
| Fisherbrand microtubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Folinic acid calcium salt hydrate | Millipore Sigma | F7878 | |
| Glucose | Millipore Sigma | 158968 | |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | |
| iXon X3 camera | Andor | DU-897E-CS0 | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | Millipore Sigma | G1501 | |
| Light mineral oil | Millipore Sigma | M5904 | |
| Magnesium acetate tetrahydrate | Millipore Sigma | M5661 | |
| Mini-extruder kit (including syringe holder and extruder stand) | Avanti | 610020 | |
| Olympus IX81 Inverted Microscope | Olympus | IX21 | |
| Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective | Olympus | 1-U2B933 | |
| PEO-b-PBD | Polymer Source | P41745-BdEO | |
| pET28b-PRSP-GluR0-sfGFP plasmid DNA | Homemade | N/A | |
| pET28b-sfGFP-sfCherry(1-10) plasmid DNA | Homemade | N/A | |
| pET28b-WT-GluR0-sfGFP plasmid DNA | Homemade | N/A | |
| POPC lipid in chloroform | Avanti | 850457C | |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | P9541 | |
| PUREfrex 2.0 | Cosmo Bio USA | GFK-PF201 | |
| Ribonucleotide Solution Set | New England BioLabs | N0450 | |
| RNase Inhibitor, Murine | New England BioLabs | M0314S | |
| RTS Amino Acid Sampler | Biotechrabbit | BR1401801 | |
| Sodium chloride | Millipore Sigma | S9888 | |
| Spermidine | Millipore Sigma | S2626 | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S0389 | |
| VAPRO Vapor Pressure Osmometer Model 5600 | ELITechGroup | VAPRO 5600 |
References
- Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (9), 644-650 (2009).
- Lin, A. J., Sihorwala, A. Z., Belardi, B. Engineering tissue-scale properties with synthetic cells: Forging one from many. ACS Synth Biol. 12 (7), 1889-1907 (2023).
- Powers, J., Jang, Y. Advancing biomimetic functions of synthetic cells through compartmentalized cell-free protein synthesis. Biomacromolecules. 24 (12), 5539-5550 (2023).
- Jiang, W., et al. Artificial cells: Past, present and future. ACS Nano. 16 (10), 15705-15733 (2022).
- Groaz, A., et al. Engineering spatiotemporal organization and dynamics in synthetic cells. WIREs Nanomed Nanobiotech. 13 (3), 1685 (2021).
- Sharma, B., Moghimianavval, H., Hwang, S. W., Liu, A. P. Synthetic cell as a platform for understanding membrane-membrane interactions. Membranes. 11 (12), 912 (2021).
- Bashirzadeh, Y., et al. Actin crosslinker competition and sorting drive emergent GUV size-dependent actin network architecture. Commun Biol. 4 (1), 1-11 (2021).
- Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes. iScience. 25 (5), 104236 (2021).
- Berhanu, S., Ueda, T., Kuruma, Y. Artificial photosynthetic cell producing energy for protein synthesis. Nat Commun. 10 (1), 1325 (2019).
- Ji, Y., Chakraborty, T., Wegner, S. V. Self-regulated and bidirectional communication in synthetic cell communities. ACS Nano. 17 (10), 8992-9002 (2023).
- Moghimianavval, H., Loi, K. J., Hwang, S. W., Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Light-based juxtacrine signaling between synthetic cells. bioRxiv. , (2024).
- Boyd, M. A., Thavarajah, W., Lucks, J. B., Kamat, N. P. Robust and tunable performance of a cell-free biosensor encapsulated in lipid vesicles. Science Advances. 9 (1), 6605 (2023).
- Schneider, B., et al.
- Noireaux, V., Liu, A. P. The new age of cell-free biology. Annu Rev Biomed Eng. 22 (1), 51-77 (2020).
- Majumder, S., et al. Cell-sized mechanosensitive and biosensing compartment programmed with DNA. Chem. Commun. 53 (53), 7349-7352 (2017).
- Poddar, A., et al. Membrane stretching activates calcium permeability of a putative channel Pkd2 during fission yeast cytokinesis. MBoC. 33 (14), (2022).
- Sachse, R., Dondapati, S. K., Fenz, S. F., Schmidt, T., Kubick, S. Membrane protein synthesis in cell-free systems: From bio-mimetic systems to bio-membranes. FEBS Letters. 588 (17), 2774-2781 (2014).
- Dondapati, S. K., et al. Functional reconstitution of membrane proteins derived from eukaryotic cell-free systems. Front Pharmacol. 10, 917 (2019).
- Majumder, S., et al. In vitro synthesis and reconstitution using mammalian cell-free lysates enables the systematic study of the regulation of LINC complex assembly. Biochemistry. 61 (14), 1495-1507 (2022).
- Niwa, T., et al. Comprehensive study of liposome-assisted synthesis of membrane proteins using a reconstituted cell-free translation system. Sci Rep. 5 (1), 18025 (2015).
- Moghimianavval, H., Hsu, Y. Y., Groaz, A., Liu, A. P. In vitro reconstitution platforms of mammalian cell-free expressed membrane proteinsmembrane proteins. Methods Mol Biol. 2433, 105-120 (2022).
- Eaglesfield, R., Madsen, M. A., Sanyal, S., Reboud, J., Amtmann, A. Cotranslational recruitment of ribosomes in protocells recreates a translocon-independent mechanism of proteorhodopsin biogenesis. iScience. 24 (5), 102429 (2021).
- Steinküher, J., et al. Improving cell-free expression of membrane proteins by tuning ribosome cotranslational membrane association and nascent chain aggregation. bioRxiv. , (2023).
- Chen, G. Q., Cui, C., Mayer, M. L., Gouaux, E. Functional characterization of a potassium-selective prokaryotic glutamate receptor. Nature. 402 (6763), 817-821 (1999).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Hsu, Y. Y., et al. Calcium-triggered DNA-mediated membrane fusion in synthetic cells. Chemical Communications. 59 (57), 8806-8809 (2023).
- Moghimianavval, H., et al. Engineering functional membrane-membrane interfaces by interspy. Small. 19 (13), 2202104 (2023).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. J Vis Exp. (79), e50762 (2013).
- Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression. PNAS. 116 (10), 4031-4036 (2019).
- Kostarelos, K., Tadros, T. F., Luckham, P. F. Physical conjugation of (tri-) block copolymers to liposomes toward the construction of sterically stabilized vesicle systems. Langmuir. 15 (2), 369-376 (1999).
- Adir, O., et al. Preparing protein producing synthetic cells using cell free bacterial extracts, liposomes and emulsion transfer. J Vis Exp. (158), e60829 (2020).
- van de Cauter, L., van Buren, L., Koenderink, G. H., Ganzinger, K. A. Exploring giant unilamellar vesicle production for artificial cells - current challenges and future directions. Small Methods. 7 (12), 2300416 (2023).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1666 (1), 105-117 (2004).
- Guo, Y. Detergent-free systems for structural studies of membrane proteins. Biochem Soc Trans. 49 (3), 1361-1374 (2021).
- Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. J Vis Exp. (177), e63332 (2021).
- Hwang, S. W., et al. Hybrid vesicles enable mechano-responsive hydrogel degradation. Angew Chemie Int Ed. 62 (41), e202308509 (2023).
- Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking. Chem Soc Rev. 47 (23), 8572-8610 (2018).
- Tsumoto, K., Hayashi, Y., Tabata, J., Tomita, M. A reverse-phase method revisited: Rapid high-yield preparation of giant unilamellar vesicles (GUVs) using emulsification followed by centrifugation. Colloids Surf A: Physicochem Eng Asp. 546, 74-82 (2018).
- Huang, Y. L., Walker, A. S., Miller, E. W. A photostable silicon rhodamine platform for optical voltage sensing. J Am Chem Soc. 137 (33), 10767-10776 (2015).
- Bailoni, E., et al. Minimal out-of-equilibrium metabolism for synthetic cells: A membrane perspective. ACS Synth Biol. 12 (4), 922-946 (2023).
