Summary
Bu protokol, bir model membran proteininin lipid çift tabakasına sentezinin ve dahil edilmesinin araştırılması için dev bir unilamellar vezikül (GUV) içinde bir hücresiz ekspresyon (CFE) sistemini kapsüllemek için kullanılan ters emülsiyon yöntemini tanımlar.
Abstract
Hücresiz ekspresyon (CFE) sistemleri, sentetik biyolojide, sentetik hücrelerde biyoalgılama ve enerji rejenerasyonu gibi hücresel işlevlerin biyomimikrisine izin veren güçlü araçlardır. Bununla birlikte, çok çeşitli hücresel süreçlerin yeniden yapılandırılması, zar proteinlerinin sentetik hücrelerin zarına başarılı bir şekilde yeniden yapılandırılmasını gerektirir. Çözünür proteinlerin ekspresyonu genellikle yaygın CFE sistemlerinde başarılı olsa da, sentetik hücrelerin lipid çift katmanlarında zar proteinlerinin yeniden yapılandırılmasının zor olduğu kanıtlanmıştır. Burada, bir model membran proteini olan bakteriyel glutamat reseptörünün (GluR0), dev unilamellar veziküllerde (GUV'ler) sentetik hücreler içinde CFE reaksiyonunun kapsüllenmesine ve inkübasyonuna dayalı olarak model sentetik hücreler olarak sulandırılması için bir yöntem gösterilmiştir. Bu platformu kullanarak, GluR0'ın N-terminal sinyal peptidinin proteorhodopsin sinyal peptidi ile ikame edilmesinin, GluR0'ın hibrit GUV'lerin membranlarına başarılı kotranslasyonel translokasyonu üzerindeki etkisi gösterilmiştir. Bu yöntem, sentetik hücrelerde çeşitli zar proteinlerinin hücresiz olarak yeniden yapılandırılmasına izin verecek sağlam bir prosedür sağlar.
Introduction
Aşağıdan yukarıya sentetik biyoloji, biyomühendislik, ilaç dağıtımı ve rejeneratif tıpta çok sayıda potansiyel uygulamaya sahip gelişmekte olan bir alan olarak son on yılda artan bir ilgi kazanmıştır 1,2. Özellikle aşağıdan yukarıya sentetik biyolojinin temel taşı olarak sentetik hücrelerin geliştirilmesi, sentetik hücrelerin umut verici uygulamalarının yanı sıra in vitro biyofiziksel çalışmaları kolaylaştıran hücre benzeri fiziksel ve biyokimyasal özellikleri nedeniyle çok çeşitli bilimsel toplulukları cezbetmiştir 3,4,5,6 . Sentetik hücreler genellikle farklı biyolojik süreçlerin yeniden yaratıldığı hücre büyüklüğünde dev unilamellar veziküllerde (GUV'ler) tasarlanır. Hücre hücre iskeletininyeniden yapılandırılması 7,8, ışığa bağlı enerji yenilenmesi9, hücresel iletişim10,11 ve biyoalgılama12, sentetik hücrelerde hücre benzeri davranışları yeniden yapılandırma çabalarına örnektir.
Bazı hücresel süreçler çözünür proteinlere dayanırken, doğal hücrelerin algılama ve iletişim gibi birçok özelliği genellikle iyon kanalları, reseptörler ve taşıyıcılar dahil olmak üzere zar proteinlerini kullanır. Sentetik hücre gelişimindeki en büyük zorluk, zar proteinlerinin yeniden yapılandırılmasıdır. Lipid çift tabakalarında geleneksel membran proteini sulandırma yöntemleri deterjan aracılı saflaştırmaya dayansa da, bu tür yöntemler zahmetlidir, ekspresyon konakçısı için toksik olan proteinler için etkisizdir veya genellikle GUV'lerde membran proteini sulandırması için uygun değildir13.
Protein ekspresyonu için alternatif bir yöntem, hücresiz ekspresyon (CFE) sistemleridir. CFE sistemleri, sentetik biyolojide, hücre lizatı veya saflaştırılmış transkripsiyon-translasyon makinesi kullanarak çeşitli proteinlerin in vitro ekspresyonuna izin veren güçlü bir araç olmuştur14. CFE sistemleri ayrıca GUV'lerde kapsüllenebilir, böylece hafif hasat yapan sentetik hücrelerin9 veya mekanosensitif biyosensörlerin15,16 oluşturulması gibi çeşitli uygulamalar için programlanabilen bölümlere ayrılmış protein sentezi reaksiyonlarına izin verir. Rekombinant protein ekspresyonu yöntemlerine benzer şekilde, CFE sistemlerinde membran protein ekspresyonu zordur17. CFE sistemlerinde agregasyon, yanlış katlanma ve translasyon sonrası modifikasyon eksikliği, CFE sistemleri kullanılarak başarılı membran protein sentezini engelleyen başlıca darboğazlardır. CFE sistemlerini kullanarak aşağıdan yukarıya membran proteininin sulandırılmasının zorluğu, kısmen sinyal peptitlerine, sinyal tanıma parçacıklarına, translokonlara ve şaperonlama moleküllerine dayanan karmaşık bir membran protein biyogenez yolunun olmamasından kaynaklanmaktadır. Bununla birlikte, son zamanlarda, çok sayıda çalışma, translasyon sırasında mikrozomlar veya lipozomlar gibi membranöz yapıların varlığının başarılı membran protein ekspresyonunu desteklediğini göstermiştir 18,19,20,21. Ek olarak, Eaglesfield ve ark. ve Steinküher ve ark. membran proteininin N-terminalinde sinyal peptitleri olarak bilinen spesifik hidrofobik alanların dahil edilmesinin, ekspresyonunu önemli ölçüde iyileştirebileceğini bulmuşlardır 22,23. Toplamda, bu çalışmalar, protein translasyonu GUV membranının varlığında meydana gelirse ve uygun N-terminal sinyal peptidi kullanılırsa, sentetik hücrelerde membran proteininin sulandırılması zorluğunun üstesinden gelinebileceğini düşündürmektedir.
Burada, GUV'lerde membran proteininin yeniden yapılandırılması için rekombinant elementler (PURE) CFE reaksiyonları kullanılarak protein sentezinin kapsüllenmesi için bir protokol sunulmaktadır. Bakteriyel glutamat reseptörü24 (GluR0) model membran proteini olarak seçilir ve N-terminal sinyal peptidinin membran sulandırması üzerindeki etkisi incelenir. Eaglesfield ve ark.22 tarafından membran proteini sulandırma verimliliğini arttırdığı gösterilen proteorhodopsin sinyal peptidinin etkisi, PRSP-GluR0 olarak gösterilen mutasyona uğramış bir GluR0 varyantı oluşturularak araştırılır ve doğal sinyal peptidini barındıran vahşi tip GluR0 (bundan sonra WT-GluR0 olarak anılacaktır) ile ekspresyonu ve membran lokalizasyonu karşılaştırılır. Bu protokol, CFE kapsüllemesi için sağlam hale getiren modifikasyonlarla birlikte ters çevrilmiş emülsiyon yöntemine25 dayanmaktadır. Sunulan yöntemde, CFE reaksiyonları ilk olarak, CFE sistemini içeren ve lipid tek tabakası tarafından stabilize edilen mikron boyutunda damlacıklar üreten bir yağ içinde lipid çözeltisi kullanılarak emülsifiye edilir. Emülsiyon damlacıkları daha sonra başka bir lipit tek tabakası ile doyurulmuş bir yağ-su arayüzünün üzerine katmanlanır. Emülsiyon damlacıkları daha sonra merkezkaç kuvveti yoluyla yağ-su arayüzü boyunca hareket etmeye zorlanır. Bu işlem sayesinde, damlacıklar başka bir tek tabaka elde eder, böylece iki tabakalı bir lipit vezikül oluşturur. CFE reaksiyonunu içeren GUV'ler daha sonra inkübe edilir, bu sırada membran proteini eksprese edilir ve GUV membranına dahil edilir. Bu protokol, GluR0'ın hücresiz ekspresyonu için belirtilmiş olsa da, diğer zar proteinlerinin hücresiz sentezi veya hücre iskeleti yeniden yapılandırması veya zar füzyon çalışmaları gibi farklı sentetik hücre uygulamaları için kullanılabilir26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma için kullanılan reaktifler ve ekipman Malzeme Tablosunda verilmiştir.
1. Küçük unilamellar veziküllerin (SUV'lar) varlığında toplu CFE reaksiyonları
- SUV hazırlığı
NOT: Bu adımın, kloroform ile çalışmaya ilişkin güvenlik talimatlarına uygun olarak çeker ocakta gerçekleştirilmesi gerekir.- Kloroform içinde çözünmüş 76 μL 25 mg / mL POPC stok çözeltisini aktararak bir cam şişede 5 mM 1-palmitoil-2-oleoil-glisero-3-fosfokolin (POPC) SUV hazırlayın.
- Cam şişeyi nazikçe döndürürken, altta bir kuru lipit filmi oluşturmak için şişeye hafif bir argon akışı üfleyin. Daha sonra, cam şişeyi, fazla kloroformu buharlaştırmak için kapağı gevşek bir şekilde vidalanmış bir desikatöre aktarın.
- Cam şişeyi kurutucuda 1 saat tutun. Ardından, lipid filmi çözmek için 0,5 mL ultra saf deiyonize su ekleyin ve yaklaşık 2 dakika girdap yapın.
- İki filtre desteğini deiyonize suya batırarak ve bunları iç membran desteklerinin her birine yerleştirerek bir mini ekstrüzyon aparatı kurun. Ardından, 100 nm'lik bir polikarbonat filtreyi ıslatın ve ekstrüder dış kasası ve tespit somunu tarafından bir arada tutulan iki iç membran desteği arasına yerleştirin. Bu kurulumu ekstrüder standına yerleştirin.
- İki adet 1 mL gaz geçirmez şırıngayı ultra saf deiyonize su ile 3 kez yıkayın.
- Lipit-su karışımı örneğini 1 mL gaz geçirmez şırıngalardan birine yükleyin ve şırıngayı yerinde tutmak için salıncak kolu klipslerini kullanarak mini ekstrüderin bir ucuna yerleştirin. İkinci şırıngayı mini ekstrüderin diğer ucuna yerleştirin ve tamamen bastırıldığından emin olun.
NOT: Şırıngaya lipit-su karışımı yüklerken, mini ekstrüderden geçirmeden önce şırıngada hava olmadığından emin olun. - Lipit-su karışımını orijinal şırıngadan mini ekstrüder aparatından boş şırıngaya nazikçe geçirin. SUV'lar oluşturmak için bu adımı 11 kez tekrarlayın. SUV'ları 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
NOT: SUV çözümü 4 °C'de 2 haftaya kadar saklanabilir.
- CFE reaksiyon düzeneği
- CFE reaksiyonunu, aşağıda ayrıntıları verilen küçük değişikliklerle üretici tarafından sağlanan hücresiz ekspresyon protokolünü izleyerek birleştirin.
- 10 μL Çözelti 1 (amino asitler, NTP'ler, tRNA'lar ve enzimler için substratlar ve gerekli tampon içeren), 1 μL Çözelti 2 (% 20 gliserol içindeki proteinler), 2 μL Çözelti 3 (ribozom (20 μM)), çözünür sfGFP-sfCherry (1-10) 27 (bundan sonra çözünür sfGFP olarak anılacaktır), WT-GluR0-sfGFP veya PRSP-GluR0-sfGFP (10-60 ng / 1000 baz çifti) için kodlayan uygun miktarda DNA'yı karıştırın, 1 μL murin RNAse inhibitörü ve membran proteinleri için 4 μL 5 mM SUV çözeltisi veya çözünür proteinler için 4 μL su.
- Ultra saf deiyonize su ekleyerek reaksiyonun son hacmini 20 μL'ye getirin.
NOT: CFE sistemini monte ederken, tüm bileşenler buz üzerinde tutulmalıdır. Tüm malzemeler sıcaklığa duyarlıdır ve oda sıcaklığına ulaştıklarında bozulabilirler.
- CFE reaksiyon inkübasyonu ve izlenmesi
- CFE çözeltisini 96 oyuklu konik bir V-alt plakaya aktarın. Reaksiyon sırasında buharlaşmayı önlemek için, plakayı bir sızdırmazlık filmi kullanarak örtün.
- Plakayı 37 °C'de bir plaka okuyucuda 4-5 saat inkübe edin ve her 2 dakikada bir 488 nm/528 nm uyarma/emisyon dalga boylarında 100'lük bir kazançla GFP sinyalini ölçerek CFE reaksiyonunu izleyin.
2. GUV'lerde kapsüllenmiş CFE reaksiyonları
- GUV dış tampon çözeltisinin hazırlanması
- 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde 1.5 μL 1 M spermidin, 37.5 μL 100 mM ATP, 25 μL 100 mM GTP, 12.5 μL 100 mM CTP, 12.5 μL 100 mM UTP, 25 μL 1 M kreatin fosfat, 18 μL 1 M magnezyum asetat, 93.33 μL 3 M potasyum glutamat karıştırın, 50 μL 1 M HEPES KOH (pH 7.4), 1.15 μL 332 mM folinik asit, 100 μL 2 M glikoz ve 50 μL 6 mM stok çözeltisinden 20 amino asidin her birinin karışımı (Sun ve ark.28 tarafından tarif edilen protokol izlenerek hazırlanmıştır).
- Ultra saflaştırılmış deiyonize su ekleyerek çözeltinin son hacmini 1 mL'ye getirin.
NOT: Tüm bileşenler buz üzerinde tutulmalıdır. Amino asit tükenmesini önlemek için en sona amino asit karışımını ekleyin28. Çözelti 330 μL'lik alikotlarda toplanabilir ve kullanıma kadar -20 ° C'de saklanabilir.
- Yağda lipid karışımının hazırlanması
NOT: Bu adımın, kloroform ile çalışmaya ilişkin güvenlik talimatlarına uygun olarak çeker ocakta gerçekleştirilmesi gerekir.- Bir davlumbazda, 17.3 μL 25 mg / mL POPC stok çözeltisi ve 1.08 μL 50 mg / mL poli (bütadien) -b-poli (etilen oksit) (PEO-b-PBD) kopolimerini 15 mL'lik bir cam şişede karıştırın.
NOT: Nihai yağda lipid çözeltisi, sırasıyla% 95 ve% 5 POPC ve PEO-b-PBD ile 0.5 mM lipid içerir. PEO-b-PBD, protein ekspresyonu sırasında membran stabilitesini arttırmak için kullanıldı, ancak kopolimerin lipid moleküllerinden ayrı misellere toplanma eğilimini azaltmak için düşük bir molar oranda tutuldu29,30. - Kloroformu buharlaştırmak için şişeyi döndürürken cam şişeye hafif bir argon gazı akışı dikkatlice üfleyin.
- Kurutulmuş lipitleri içeren 15 mL'lik cam şişeye 1.2 mL hafif mineral yağ pipetleyin.
- Lipitleri ve yağı 10-20 saniye boyunca maksimum hızda girdaplayarak karıştırın. Çözünmüş lipit-kopolimer karışımı bulanık görünecektir.
- Yağdaki tüm olası lipid agregalarının tamamen çözünmesini ve yağ boyunca dağılmasını sağlamak için, cam şişeyi maksimum hızda 10-20 saniye daha vortekslemeden önce 20 dakika boyunca yaklaşık 50 °C'de bir fırına koyun.
- Bir davlumbazda, 17.3 μL 25 mg / mL POPC stok çözeltisi ve 1.08 μL 50 mg / mL poli (bütadien) -b-poli (etilen oksit) (PEO-b-PBD) kopolimerini 15 mL'lik bir cam şişede karıştırın.
- CFE reaksiyon montajı ve kapsüllemesi (Şekil 1 aşağıdaki adımları özetlemektedir).
- Adım 2.1'de hazırlanan 270 μL CFE dış tampon çözeltisini, 15 μL 5 M NaCl ve 15 μL'yi 4.5 M KCl'yi karıştırarak 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde 300 μL GUV dış çözeltisi hazırlayın.
NOT: Bu adımda, GUV dış çözeltisine 0,45 μL 1 M 1,4-dithiothreitol (DTT) ekleyin. NaCl ve KCl eklemenin amacı, dış çözeltinin ozmolalitesini iç CFE çözeltisiyle eşleşecek şekilde ayarlamaktır. NaCl ve KCl'nin tam hacmi, istenen ozmolalite ayarına bağlıdır. Ozmolaliteyi ayarlamak için NaCl veya KCl veya her ikisi birden eklenebilir. - GUV dış solüsyonunun üzerine 300 μL yağda lipid karışımını nazikçe pipetleyin.
NOT: Lipit-yağ karışımını eklerken, yağın sulu dış çözelti ile karışmaması önemlidir. Eklemeden sonra, yağ içinde lipid karışımı ile GUV dış çözeltisi arasında görünür bir arayüz olmalıdır. - Lipid tek tabakasının arayüzde oluşmasını ve stabilize olmasını sağlamak için yağ-su arayüzünü oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
- Bu arada, zar protein varyantlarını veya çözünür GFP'yi kodlayan plazmit DNA'sını içeren bir CFE reaksiyonu oluşturmak için bölüm 1.2.1'i izleyin. 4 μL 5 mM SUV solüsyonunu veya suyu 4 μL 1 M sükroz ile değiştirin. Bu reaksiyon GUV iç çözeltisi olacaktır.
NOT: İç ve dış çözeltilerin ozmolalitesini ölçmek için bir ozmometre kullanılmıştır. Dış çözeltinin ozmolalitesi daha sonra NaCl veya su ilavesiyle buna göre ayarlandı. CFE reaksiyonunun ozmolalitesi tipik olarak 1600 mOsm/Kg civarındadır. Reaksiyona sükroz eklenmesi, iç çözelti yoğunluğunu arttırır, böylece santrifüjleme adımı sırasında veziküllerin yağ-su arayüzü boyunca hareket etmesine izin verir. Sükroza bir alternatif, Opti-Prep yoğunluk gradyan çözeltisidir. - CFE reaksiyonunu içeren mikrosantrifüj tüpüne 600 μL lipit-yağ karışımı ekleyin ve reaksiyonu yağda lipid çözeltisinde emülsifiye etmek ve sentetik hücrelerin etrafında lipit tek tabakasını oluşturmak için ~ 1 dakika boyunca kuvvetlice yukarı ve aşağı pipetleyin.
NOT: Nihai çözeltide kabarcık olmamalı ve opak görünmelidir. - İç çözelti emülsiyonunu, yağ-su arayüzünün kurulduğu 1.5 mL mikrosantrifüj tüpündeki yağ tabakasının üzerine nazikçe pipetleyin.
NOT: Arayüzü bozmamaya veya dengesini bozmamaya dikkat edin. - 4 ° C'de 2.000 x g'de 10 dakika santrifüjleyin.
NOT: Santrifüjleme hızı bu protokol için optimize edilmiştir. Adir ve ark.31 farklı bir santrifüj hızı bildirmiştir. - Santrifüjleme bittiğinde, bir pipetleyici kullanarak fazla yağı ve dış çözeltiyi mikrosantrifüj tüpünden dikkatlice çıkarın. Kalan hacim yaklaşık 100 μL olana kadar dış çözeltiyi çıkarın.
NOT: Mikrosantrifüj tüpünün altında genellikle bir GUV peleti görülür. Bununla birlikte, görünür bir peletin olmaması, mutlaka GUV veriminin olmadığı anlamına gelmez. Bir pipetleyici kullanmak yerine, dış çözeltinin üstündeki fazla yağ aspirasyon ile çıkarılabilir. Yağdaki lipit çözeltisinin tamamen çıkarıldığından emin olmak çok önemlidir. GUV solüsyonundaki yağ kirliliği düşük kaliteli görüntülere neden olabilir. - GUV peletini kalan 100 μL'lik çözelti içinde hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin. Ardından, GUV çözeltisini inkübe etmek için temiz, 96 iyi berrak düz tabanlı bir plakaya aktarın.
- Adım 2.1'de hazırlanan 270 μL CFE dış tampon çözeltisini, 15 μL 5 M NaCl ve 15 μL'yi 4.5 M KCl'yi karıştırarak 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde 300 μL GUV dış çözeltisi hazırlayın.
3. Kapsüllenmiş CFE reaksiyon inkübasyonu ve görüntüleme
- Buharlaşmayı önlemek için plakayı bir sızdırmazlık filmi kullanarak örtün. Plakayı 37 °C'de 5-6 saat inkübe edin. Plaka okuyucuyu inkübasyon adımına hazırlamak için bir plaka okuyucu kullanılabilir ve adım 1.3.2 takip edilebilir.
- İnkübasyon bittikten sonra, 96 oyuklu plakayı bir EMCCD kamera (veya bir sCMOS kamera), DAQ-MX kontrollü lazer (veya entegre bir lazer birleştirici sistemi) ve bir CSU-X1 eğirme diski konfokal (veya bir lazer tarama konfokal) ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskobun görüntüleme aşamasına yerleştirin. GUV'ler içeren herhangi bir ROI'ye odaklanın ve Plan-Apochromat 60 x/1.4 NA objektif kullanarak 488 nm'lik bir uyarma dalga boyunda görüntüler yakalayın.
- GUV'lerin görüntülerini .tiff formatında kaydedin.
- Görüntüleri bir görüntü işleme yazılımında (ör. ImageJ veya Fiji) açın. Brightness/Contrast (Parlaklık/Kontrast ) ayar panelini açın. Parlaklığı ve kontrastı, floresan proteinleri görünür kılan uygun ayarlara ayarlayın.
- Amaç, ifade edilen farklı proteinlerin sinyal yoğunluğunu karşılaştırmaksa, önce Görüntü > Yığınlar alt menüsü altında bulunan Yığına Görüntüler panelini kullanarak farklı proteinler içeren GUV'lerin tek tek görüntülerini yığınlayın. Ardından, Parlaklık/Kontrast panelini kullanarak tüm görüntülerin parlaklığını ve kontrastını ayarlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CFE reaksiyonlarının kapsüllenmesinden önce, doğal ve proteorhodopsin sinyal peptitlerini barındıran iki GluR0-sfGFP varyantı (sinyal peptit dizileri Ek Tablo 1'de sunulmuştur) ve çözünür sfGFP, toplu reaksiyonlarda ayrı ayrı eksprese edildi ve ekspresyonları, bir plaka okuyucu kullanılarak sfGFP sinyali tespit edilerek izlendi (Şekil 2A). Membran proteinleri, 100 nm SUV'ların yokluğunda veya varlığında eksprese edildi. Ek olarak, sfGFP sinyalini konsantrasyonuyla ilişkilendiren bir kalibrasyon eğrisi kullanılarak (Ek Şekil 1), sentezlenen proteinlerin konsantrasyonları tahmin edildi (Ek Tablo 2). Açıkçası, çözünür sfGFP, her üç protein arasında en yüksek ekspresyona sahipti, bu da zar proteinlerinin ekspresyonunun CFE sistemine bir yük getirdiğini, böylece reaksiyonu yavaşlattığını ve verimini düşürdüğünü gösteriyor. Ek olarak, ortalama olarak, SUV'ların varlığında zar proteinlerini eksprese eden reaksiyonlar, SUV'ların eksik olduğu reaksiyonlara kıyasla daha yüksek sfGFP sinyali gösterdi. Bu gözlem, zar proteinlerinin ekspresyonunun CFE sistemlerinin protein üretme kapasitesini azalttığını gösteren Steinküher ve arkadaşlarının bulgularıyla uyumludur23. Bununla birlikte, toplu CFE reaksiyonunda protein ekspresyonunun başarılı bir şekilde gösterilmesi göz önüne alındığında, kapsüllenmiş CFE'nin GUV'ler içindeki proteinleri de sentezleyeceği düşünülebilir.
Daha sonra, bireysel CFE reaksiyonları, GluR0'ın, yani WT-GluR0, PRSP-GluR0 ve çözünür sfGFP'nin varyantlarını eksprese etmek için ters emülsiyon yöntemi kullanılarak GUV'lerde kapsüllendi. GluR0 doğal sinyal peptidini barındıran WT-GluR0, mükemmel ekspresyon ve membran lokalizasyonu gösterirken (Şekil 2B, sol panel), proteorhodopsin N-terminal sinyal peptidine sahip muadili PRSP-GluR0, benzer güçlü membran lokalizasyonu göstermedi. PRSP-GluR0'ın agregasyona ve punktat oluşumuna daha yatkın olduğu bulunmuştur (Şekil 2B, orta panel). Beklendiği gibi, çözünür sfGFP GUV'lerde eksprese edildi ve GUV lümeninde kaldı (Şekil 2B, sağ panel; GUV kohortlarının görüntüleri için Ek Şekil 2'ye bakın).
Şekil 1: Ters çevrilmiş emülsiyonun deneysel adımları. (1) Protokolün 2.3.1 adımından 2.3.3 adımına kadar olan adımlar, lipit-yağ karışımı ve dış tampon çözeltisinin arayüzünde lipid tek tabakasının montajını göstermek için görselleştirilir. (2) Protokolün 2.3.5 adımının görselleştirilmesi, iç CFE çözeltisini kapsülleyen emülsifiye damlacıklar etrafında lipid tek tabakasının oluşumunu temsil etmek için burada gösterilmiştir. (3) Protokolün 2.3.6 adımı, tek tabakalı GUV'lerin, bir lipit-yağ karışımı ve dış tampon çözeltisinin arayüzünde lipid tek tabakası ile mikrosantrifüj tüpüne eklenmesini gösterir. (4) Burada, santrifüjlemenin dış çözeltide bir GUV peleti oluşumuna yol açtığı Adım 2.3.7 gösterilmektedir. (5) Adım 2.3.8 burada, fazla yağdaki lipid karışımının ve dış çözeltinin uzaklaştırılması işlemini gösteren gösterilmiştir. (6) Son olarak, GUV peletinin dış çözelti içinde yeniden süspanse edildiği ve GUV'lerin inkübasyona hazır olduğu ve ardından görüntülemenin yapıldığı adım 2.3.9 burada gösterilmektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Toplu CFE reaksiyonlarında ve CFE reaksiyonlarını kapsülleyen GUV'lerde protein ekspresyonu. (A) WT-GluR0-sfGFP, PRSP-GluR0-sfGFP ve çözünür sfGFP'yi ifade eden bireysel toplu CFE reaksiyonlarının floresan okumaları. Çözünür sfGFP grafiği, plaka okuyucu ölçümlerinin aşırı doygunluğunu önlemek için 2,5 μL'lik bir reaksiyondan (standart reaksiyon hacmi 20 μL'dir) gelen sinyali temsil eder. Veriler ortalama ± S.D, n = 3 olarak sunulmuştur. (B) Sol: WT-GluR0-sfGFP'yi eksprese eden bir GUV kapsülleyici CFE reaksiyonunun temsili bir konfokal görüntüsü. Orta: PRSP-GluR0-sfGFP'yi eksprese eden CFE reaksiyonunu kapsülleyen GUV'lerin temsili bir konfokal görüntüsü. Sağ: Çözünür sfGFP'yi eksprese eden bir GUV kapsülleyici CFE reaksiyonunun temsili bir konfokal görüntüsü. Ölçek çubukları: 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: sfGFP sinyal kalibrasyon eğrisi ve buna karşılık gelen doğrusal regresyon analizi. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 2: (Solda) WT-GluR0-sfGFP, (ortada) PRSP-GluR0-sfGFP ve (sağda) çözünür sfGFP eksprese eden GUV kohortlarının temsili konfokal görüntüsü. Ölçek çubuğu: 10 μm. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Tablo 1: Yabani tip ve proteorhodopsin sinyal peptitlerinin amino asit dizisi. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Tablo 2: Toplu CFE reaksiyonlarında sentezlenen proteinlerin konsantrasyonu. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hücre sinyalizasyonu veya hücre uyarımı gibi moleküllerin veya bilgilerin hücre zarı boyunca transferine bağlı olan hemen hemen her hücresel süreç, zar proteinleri gerektirir. Bu nedenle, zar proteinlerinin sulandırılması, farklı uygulamalar için çeşitli sentetik hücre tasarımlarının gerçekleştirilmesinde ana darboğaz haline gelmiştir. Biyolojik membranlardaki membran proteinlerinin geleneksel deterjan aracılı sulandırılması, hafif şişme veya elektroformasyon gibi GUV üretim yöntemleri gerektirir. Şişme yaklaşımları genellikle küçük boyutlu veziküller üretir ve genellikle sentetik hücreler üretilirken olduğu gibi karmaşık çözeltiler kapsüllendiğinde elektroformasyon verimi önemli ölçüde düşer32. Ek olarak, deterjanlar zar proteinini çözündürür ve sulandırma işlemi sırasında uzaklaştırılmaları proteinin yanlış katlanmasına neden olabilir33,34. Öte yandan, burada sunulan yaklaşım, zar proteininin,22 hücresindeki doğal protein biyogenez yoluna daha çok benzeyen lipid çift tabakasına birlikte translasyonel olarak dahil edilmesine dayanır.
Teknik açıdan, sunulan protokol, GUV üretimi için gerekli olan tek laboratuvar ekipmanı bir santrifüj olduğundan, daha kolay uygulama için elektroformasyon ve sürekli damlacık arayüzü geçiş kapsüllemesi 7,8,35,36 (cDICE) gibi diğer yaygın kapsülleme yöntemlerine göre avantajlıdır. Elektroformasyonun aksine, ters çevrilmiş emülsiyon yöntemi, çeşitli konsantrasyonlara sahip farklı molekül kombinasyonlarının kapsüllenmesine izin verir. Ek olarak, orijinal ters çevrilmiş emülsiyon tekniği25 ile karşılaştırıldığında, bu yaklaşım, CFE lizatlarının veya PURE sistemlerinin kapsüllenmesi için uygun olan daha kararlı GUV'ler üretir. Daha yüksek GUV stabilitesi, GUV membranı37'nin bileşiminde diblok kopolimerinin varlığına ve ayrıca arayüzün lipid molekülleri ile doyurulmasına izin veren yağ-su arayüzünün uzun inkübasyonuna borçludur. Son olarak, mikroakışkan yaklaşımların aksine, burada sunulan protokol küçük kanallar ve borular gerektirmez. Bu nedenle, CFE reaksiyonu monte edilir edilmez kapsüllenebilir ve akış eksikliği ve olası tıkanma nedeniyle GUV montajının daha kısa süresi, CFE reaksiyonunun erken başlamasını önler. Bu protokolde membran protein ekspresyonunun gösterilmesi PUREfrex reaksiyonlarına özel olsa da, bu yöntem, lizat bazlı bakteri veya memeli CFE sistemleri gibi mevcut farklı CFE sistemlerini kullanarak proteinleri sentezlemek için genişletilebilir.
Burada sunulan yaklaşım, GUV oluşum sürecinin yağa bağımlı doğasından ve kararlı GUV'lara sahip olma niyetinden kaynaklanan sınırlamalara sahiptir. Bu yaklaşım, arayüz stabilizasyonu ve yüksek GUV verimi için gerekli olan yağ-su arayüzünün uzun inkübasyon süresi nedeniyle cDICE veya mikroakışkanlar gibi diğer yöntemlere kıyasla tipik olarak daha uzundur. Ek olarak, lipit bileşimi esas olarak küçük dozlarda diğer lipitler veya blok kopolimerler ile POPC ile sınırlıyken, elektroformasyon gibi diğer yöntemler, farklı fiziksel ve kimyasal özelliklere sahip lipitlerin dahil edilmesi için daha uygundur. Bu yöntemdeki GUV membran bileşimi, CFE verimini en üst düzeye çıkarmak için POPC ve PBD-PEO'nun bir karışımı olsa da, GUV membran bileşimindeki olası varyasyonlar test edilebilir. Bununla birlikte, diğer zar proteinleri için parametrelerin daha fazla optimizasyonu gerekebilir. Damlacık emülsifikasyonu manuel pipetleme yoluyla gerçekleştiğinden, bu yöntemle üretilen GUV'ler polidisperstir ve boyut olarak oldukça heterojendir. Ayrıca, lipitlerin organik fazda çözünmesi, bazen GUV membranının iki yaprakçıkı arasında bir yağ tabakasına neden olabilir veya görüntüleme odasını görüntü kalitesine zarar verebilecek yağ ile kirletebilir. Artık yağın zorluğu için olası bir geçici çözüm, GUV oluşumu sırasında santrifüjleme ile birlikte çözücü buharlaşmasına güvenmek için Tsumoto ve ark.38 tarafından gösterildiği gibi mineral yağın dietil eter gibi uçucu bir organik çözücü ile değiştirilmesidir.
Bu çalışmada, sulandırılmış mekano- veya ışığa duyarlı kanal işlevselliğini araştırmak için kullanılan önceki tahlillerden esinlenen kanal fonksiyonunun bir gösterimi bulunmamakla birlikte, floresan mikroskobu tabanlı bir tahlil özetlenmiştir. GluR0 kanalının açılmasının K+ iyonları24 için membran iletkenliğini arttırdığı bildirilmektedir. CFE reaksiyonları zaten yüksek konsantrasyonda K+ içerdiğinden, tipik potasyum indikatörleri kanal işlevselliğini değerlendirmek için uygun olmayacaktır. Bununla birlikte, potasyum akışı membran potansiyelini değiştirdiğinden, DiBAC4(3)22 veya BeRST 139 gibi hassas membran potansiyel göstergeleri, glutamat varlığında GluR0 aktivitesini bildirebilir.
Sentetik hücrelerde zar proteinlerinin başarılı bir şekilde sulandırılması, doğal hücreleri daha yakından taklit eden benzeri görülmemiş yeteneklere sahip sentetik hücreler oluşturmak için sayısız olasılık sunar. Sentetik hücrelerin mevcut önemli bir dezavantajı, enerjiyi yeniden üretememeleri ve geri dönüştürememeleridir. Bununla birlikte, büyük ölçüde zar proteinlerine dayanan hafif ve kimyasal bağımlı enerji rejenerasyon şemalarıyla, uzun ömürlü sentetik hücreleröngörülebilir 40. CFE sistemlerinin kullanılması, belirli görevleri toplu olarak yerine getirebilen çoklu zar proteinlerinin yeniden yapılandırılmasına izin verir. Örneğin, burada tarif edilen GluR0'a benzer bir ligand kapılı iyon kanalının, farklı voltaj kapılı iyon kanallarıyla birlikte yeniden yapılandırılması, uyarılabilir bir nöron benzeri sentetik hücrenin inşasına yol açabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.
Acknowledgments
APL, Ulusal Bilim Vakfı (EF1935265), Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01-EB030031 ve R21-AR080363) ve Ordu Araştırma Ofisi'nden (80523-BB) destek almaktadır
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 nm polycarbonate filter | STERLITECH | 1270193 | |
| 96 Well Clear Bottom Plate | ThermoFisher Scientific | 165305 | |
| BioTek Synergy H1M Hybrid Multi-Mode Reader | Agilent | 11-120-533 | |
| Creatine phosphate | Millipore Sigma | 10621714001 | |
| CSU-X1 Confocal Scanner Unit | Yokogawa | CSU-X1 | |
| Density gradient medium (Optiprep) | Millipore Sigma | D1556 | Optional to switch with sucrose in inner solution |
| Filter supports | Avanti | 610014 | |
| Fisherbrand microtubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Folinic acid calcium salt hydrate | Millipore Sigma | F7878 | |
| Glucose | Millipore Sigma | 158968 | |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | |
| iXon X3 camera | Andor | DU-897E-CS0 | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | Millipore Sigma | G1501 | |
| Light mineral oil | Millipore Sigma | M5904 | |
| Magnesium acetate tetrahydrate | Millipore Sigma | M5661 | |
| Mini-extruder kit (including syringe holder and extruder stand) | Avanti | 610020 | |
| Olympus IX81 Inverted Microscope | Olympus | IX21 | |
| Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective | Olympus | 1-U2B933 | |
| PEO-b-PBD | Polymer Source | P41745-BdEO | |
| pET28b-PRSP-GluR0-sfGFP plasmid DNA | Homemade | N/A | |
| pET28b-sfGFP-sfCherry(1-10) plasmid DNA | Homemade | N/A | |
| pET28b-WT-GluR0-sfGFP plasmid DNA | Homemade | N/A | |
| POPC lipid in chloroform | Avanti | 850457C | |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | P9541 | |
| PUREfrex 2.0 | Cosmo Bio USA | GFK-PF201 | |
| Ribonucleotide Solution Set | New England BioLabs | N0450 | |
| RNase Inhibitor, Murine | New England BioLabs | M0314S | |
| RTS Amino Acid Sampler | Biotechrabbit | BR1401801 | |
| Sodium chloride | Millipore Sigma | S9888 | |
| Spermidine | Millipore Sigma | S2626 | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S0389 | |
| VAPRO Vapor Pressure Osmometer Model 5600 | ELITechGroup | VAPRO 5600 |
References
- Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (9), 644-650 (2009).
- Lin, A. J., Sihorwala, A. Z., Belardi, B. Engineering tissue-scale properties with synthetic cells: Forging one from many. ACS Synth Biol. 12 (7), 1889-1907 (2023).
- Powers, J., Jang, Y. Advancing biomimetic functions of synthetic cells through compartmentalized cell-free protein synthesis. Biomacromolecules. 24 (12), 5539-5550 (2023).
- Jiang, W., et al. Artificial cells: Past, present and future. ACS Nano. 16 (10), 15705-15733 (2022).
- Groaz, A., et al. Engineering spatiotemporal organization and dynamics in synthetic cells. WIREs Nanomed Nanobiotech. 13 (3), 1685 (2021).
- Sharma, B., Moghimianavval, H., Hwang, S. W., Liu, A. P. Synthetic cell as a platform for understanding membrane-membrane interactions. Membranes. 11 (12), 912 (2021).
- Bashirzadeh, Y., et al. Actin crosslinker competition and sorting drive emergent GUV size-dependent actin network architecture. Commun Biol. 4 (1), 1-11 (2021).
- Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes. iScience. 25 (5), 104236 (2021).
- Berhanu, S., Ueda, T., Kuruma, Y. Artificial photosynthetic cell producing energy for protein synthesis. Nat Commun. 10 (1), 1325 (2019).
- Ji, Y., Chakraborty, T., Wegner, S. V. Self-regulated and bidirectional communication in synthetic cell communities. ACS Nano. 17 (10), 8992-9002 (2023).
- Moghimianavval, H., Loi, K. J., Hwang, S. W., Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Light-based juxtacrine signaling between synthetic cells. bioRxiv. , (2024).
- Boyd, M. A., Thavarajah, W., Lucks, J. B., Kamat, N. P. Robust and tunable performance of a cell-free biosensor encapsulated in lipid vesicles. Science Advances. 9 (1), 6605 (2023).
- Schneider, B., et al.
- Noireaux, V., Liu, A. P. The new age of cell-free biology. Annu Rev Biomed Eng. 22 (1), 51-77 (2020).
- Majumder, S., et al. Cell-sized mechanosensitive and biosensing compartment programmed with DNA. Chem. Commun. 53 (53), 7349-7352 (2017).
- Poddar, A., et al. Membrane stretching activates calcium permeability of a putative channel Pkd2 during fission yeast cytokinesis. MBoC. 33 (14), (2022).
- Sachse, R., Dondapati, S. K., Fenz, S. F., Schmidt, T., Kubick, S. Membrane protein synthesis in cell-free systems: From bio-mimetic systems to bio-membranes. FEBS Letters. 588 (17), 2774-2781 (2014).
- Dondapati, S. K., et al. Functional reconstitution of membrane proteins derived from eukaryotic cell-free systems. Front Pharmacol. 10, 917 (2019).
- Majumder, S., et al. In vitro synthesis and reconstitution using mammalian cell-free lysates enables the systematic study of the regulation of LINC complex assembly. Biochemistry. 61 (14), 1495-1507 (2022).
- Niwa, T., et al. Comprehensive study of liposome-assisted synthesis of membrane proteins using a reconstituted cell-free translation system. Sci Rep. 5 (1), 18025 (2015).
- Moghimianavval, H., Hsu, Y. Y., Groaz, A., Liu, A. P. In vitro reconstitution platforms of mammalian cell-free expressed membrane proteinsmembrane proteins. Methods Mol Biol. 2433, 105-120 (2022).
- Eaglesfield, R., Madsen, M. A., Sanyal, S., Reboud, J., Amtmann, A. Cotranslational recruitment of ribosomes in protocells recreates a translocon-independent mechanism of proteorhodopsin biogenesis. iScience. 24 (5), 102429 (2021).
- Steinküher, J., et al. Improving cell-free expression of membrane proteins by tuning ribosome cotranslational membrane association and nascent chain aggregation. bioRxiv. , (2023).
- Chen, G. Q., Cui, C., Mayer, M. L., Gouaux, E. Functional characterization of a potassium-selective prokaryotic glutamate receptor. Nature. 402 (6763), 817-821 (1999).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Hsu, Y. Y., et al. Calcium-triggered DNA-mediated membrane fusion in synthetic cells. Chemical Communications. 59 (57), 8806-8809 (2023).
- Moghimianavval, H., et al. Engineering functional membrane-membrane interfaces by interspy. Small. 19 (13), 2202104 (2023).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. J Vis Exp. (79), e50762 (2013).
- Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression. PNAS. 116 (10), 4031-4036 (2019).
- Kostarelos, K., Tadros, T. F., Luckham, P. F. Physical conjugation of (tri-) block copolymers to liposomes toward the construction of sterically stabilized vesicle systems. Langmuir. 15 (2), 369-376 (1999).
- Adir, O., et al. Preparing protein producing synthetic cells using cell free bacterial extracts, liposomes and emulsion transfer. J Vis Exp. (158), e60829 (2020).
- van de Cauter, L., van Buren, L., Koenderink, G. H., Ganzinger, K. A. Exploring giant unilamellar vesicle production for artificial cells - current challenges and future directions. Small Methods. 7 (12), 2300416 (2023).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1666 (1), 105-117 (2004).
- Guo, Y. Detergent-free systems for structural studies of membrane proteins. Biochem Soc Trans. 49 (3), 1361-1374 (2021).
- Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. J Vis Exp. (177), e63332 (2021).
- Hwang, S. W., et al. Hybrid vesicles enable mechano-responsive hydrogel degradation. Angew Chemie Int Ed. 62 (41), e202308509 (2023).
- Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking. Chem Soc Rev. 47 (23), 8572-8610 (2018).
- Tsumoto, K., Hayashi, Y., Tabata, J., Tomita, M. A reverse-phase method revisited: Rapid high-yield preparation of giant unilamellar vesicles (GUVs) using emulsification followed by centrifugation. Colloids Surf A: Physicochem Eng Asp. 546, 74-82 (2018).
- Huang, Y. L., Walker, A. S., Miller, E. W. A photostable silicon rhodamine platform for optical voltage sensing. J Am Chem Soc. 137 (33), 10767-10776 (2015).
- Bailoni, E., et al. Minimal out-of-equilibrium metabolism for synthetic cells: A membrane perspective. ACS Synth Biol. 12 (4), 922-946 (2023).
