初期のニワトリ胚のin situハイブリダイゼーションダブルホールマウント

Summary

このビデオでは、in situハイブリダイゼーション2色全体のマウント、2つの異なる遺伝子の空間的および時間的発現パターンは、若いニワトリ胚で可視化することができる方法を示しています。このメソッドは当​​初、Davidウィルキンソン、ドミンゴスエンリケ、フィルインガムとデビッドイシュ- Horowiczによって導入された。

Abstract

ニワトリ胚は、初期胚発生の研究に貴重なツールです。その透明性、アクセス性と操作の容易さ、それを脳、神経管、体節、心臓原基の形成における遺伝子発現を研究するための理想的なツールとなっています。このビデオでは、in situハイブリダイゼーションの2色全体のマウントで別の手順を示し、まず、胚は卵から解剖し、パラホルムアルデヒドで固定されています。第二に、胚は、プレハイブリダイゼーションのために処理されます。胚は、2つの異なるプローブを、DIGに結​​合された1つ、およびFITCに結合された1つでハイブリダイズさせる。一晩ハイブリダイゼーション後、胚はDIG結合抗体とインキュベートされる。 DIG基板用色反応を行い、関心領域は青色表示されます。胚は、その後、FITC結合抗体とインキュベートされる。胚は、FITCによる呈色反応のために処理、および関心領域は、赤色表示されます。最後に、胚はphtographとセクショニングの固定され、処理されます。トラブルシューティングガイドも表示されます。

Protocol

パート1：胚を修正氷冷DEPC – PBSで解剖皿を埋める。氷上に置きます。ピンセットで殻をタップして卵を開いて、シェルの部分を削除してください。 鉗子によるアルブミン厚い取り外します。その胚が上向きに向くように粗い鉗子で卵黄嚢を傾けて。 はさみを使って、胚の周りに卵黄嚢の正方形をカット。 スプーンを使用して、氷冷DEPC – PBSで卵黄と場所…

Discussion

in situハイブリダイゼーション法2色全体のマウントは、関心の1つまたは2つの遺伝子を用いて、遺伝子発現の空間的および時間的パターンの両方を決定するために使用されます。アプリケーションでは、新規遺伝子の遺伝子発現パターンの評価（例えば^1,2、だけでなく、遺伝子発現、次の侮辱の変化（胚操作^3、ビーズ^4、RNAまたはDNAのエレクトロポレーション⁵構築）が含まれ…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Eggs	Animal	Charles River	Premium Fertile
Stereomicroscope	Microscope	Leica Microsystems	MZ9.5
Marsh Automatic Incubator	Tool	Lyon	RX
Hybridization Incubator	Tool	Hybaid	Micro-4
Adams Nutator orbital mixer	Tool	Fisher	14-062
Curved Forceps (1)	Tool	Electron Microscopy Sciences	72991-4C
Fine scissors	Tool	Fine Science Tools	14161-10
Spoon	Tool	Fine Science Tools	10370-18
Pasteur Capillary Pipette		Electron Microscopy Sciences	70950-12
Microcapillary tube		Sigma	P1049-1PAK	Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps
Microdissecting knife		Fine Science Tools	10056-12	Use to puncture cavities prior to in situ hybridization
Minuten pins 0.2mm diam		Fine Science Tools	26002-20	Keep pins together using a magnetic stirrer;
Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base	Reagent	Dow Corning	0001986475	Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C
Diethylpyrocarbonate (depc)	Reagent	Acros Organics	10025025	Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave
16% PFA	Reagent	Electron Microscopy Sciences	15710
Tween-20	Reagent	Sigma	P1379-100ML
Proteinase K		Sigma	P2308-5MG	Stock at 10 mg/ml in depc-H2O in 10ul aliquots. Store at -20C.
Formamide, deionized	Reagent	Ambion	9342
Yeast tRNA-25 mg	Reagent	Invitrogen	15401-011	Stock at 20 mg/ml in depc-H2O in 125ul aliquots. Store at -20C
Heparin Sodium salt	Reagent	Sigma	H4784-250MG	Stock at 50 mg/ml in depc-H2O in 100ul aliquots. Store at -20C.
SSC x20 pH5.5	Reagent	Fisher	PR-V4261
EDTA (0.5M)	PR-V4231	Fisher
SDS	Reagent	Fisher	BP166-100
Maleic acid	Reagent	Fluka	63189
Boehringer Blocking Reagent	Reagent	Roche Applied Sciences	11096176001	Use at 2% in MABT. To make, heat with MABT for 20 mn at 60C. Can make a stock and store in 1-5 ml aliquots at 20C.
Heat inactivated sheep serum	Reagent	Jackson Immuno	013-000-121	Dissolve in 10 ml H2O; heat 550C, 30 mn. Aliquot at 1ml, -20C.
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments	Reagent	Roche Applied Sciences	11093274910
NBT/BCIP stock solution	Reagent	Roche Applied Sciences	11681451001
Anti-Fluorescein-AP, Fab fragments	Reagent	Roche Applied Sciences	11426338910
2M Tris	BP1759-500	Fisher
Vector Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit	Reagent	Vector Laboratories	SK-5100
1,2,3,4-tetrahydronaphthalene	Reagent	Sigma	429325-100ML	Under hood