조기 칙 태아의 현장 하이브리드화에서 더블 전체 산

Summary

이 비디오는 현장 하이브리드화, 2 개의 다른 유전자의 공간과 시간적 표현식 패턴이 젊은 여자는 배아에서 시각 될 수있는 방법 2 색 전체 마운트를 보여줍니다. 이 방법은 원래 데이비드 윌킨슨, 도밍고스 헨리크, 필 잉엄 데이비드 이쉬 – Horowicz에 의해 도입되었다.

Abstract

여자의 난자는 초기 배아 발달의 연구에 귀중한 도구입니다. 투명성, 접근성 및 조작 용이성, 그건 뇌, 신경 튜브, 체절과 심장 primordia 형성에 유전자 발현을 연구를위한 이상적인 도구가합니다. 이 비디오는 현장 하이브리드화 2 색 전체 마운트에있는 다른 단계를 보여주는, 첫째, 배아는 난자에서 해부하고 paraformaldehyde에서 해결되었습니다. 둘째, 배아는 prehybridization에 대한 처리됩니다. 배아는 다음 두 가지 프로브, 팔 결합 하나와 FITC에 결합하여 하나 hybridized입니다. 하룻밤 하이브리드화 다음, 배 (胚)가 발굴 결합 항체와 incubated입니다. 발굴 기판에 대한 컬러 반응이 수행하고, 관심 지역은 파란색으로 나타납니다. 배아는 다음 FITC 항체와 결합 incubated입니다. 배아는 FITC와 색상 반응을 처리하고, 관심 지역은 빨간색으로 나타납니다. 마지막으로, 배아는 고정 및 처리 phtograph과 sectioning입니다. 문제 해결 가이드도 제공됩니다.

Protocol

1 부 : 배아를 고정 얼음 추위 depc – PBS로 해부 접시를 채우십시오. 얼음 계속. 포셉로 껍질을 감청하여 계란을 열고 조개 조각을 제거합니다. 포셉과 알부민 두꺼운 제거합니다. 그 배가 위쪽으로 얼굴을 너무 거친 포셉과 난황을 기울이기. 가위를 사용하여 배아 주위에 난황의 사각형 잘라. 숟가락 사용, 얼음 추위 depc – PBS에 노른자와 장소에서 배아를 제?…

Discussion

현장 하이브리드화 방식의 2 색 전체 마운트는 관심 중 하나 또는 두 개의 유전자를 사용하여 유전자 발현의 공간 및 시간적 패턴 모두를 결정하는 데 사용됩니다. 응용 프로그램은 새로운 유전자의 유전자 발현 패턴의 평가 (예 : ^1,2,뿐만 아니라 유전자 발현 다음과 모욕의 변화 (배아 조작 ^3, 구슬 ⁴ 및 RNA 또는 DNA의 electroporation ⁵ 구성)을 포함합니다.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Eggs	Animal	Charles River	Premium Fertile
Stereomicroscope	Microscope	Leica Microsystems	MZ9.5
Marsh Automatic Incubator	Tool	Lyon	RX
Hybridization Incubator	Tool	Hybaid	Micro-4
Adams Nutator orbital mixer	Tool	Fisher	14-062
Curved Forceps (1)	Tool	Electron Microscopy Sciences	72991-4C
Fine scissors	Tool	Fine Science Tools	14161-10
Spoon	Tool	Fine Science Tools	10370-18
Pasteur Capillary Pipette		Electron Microscopy Sciences	70950-12
Microcapillary tube		Sigma	P1049-1PAK	Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps
Microdissecting knife		Fine Science Tools	10056-12	Use to puncture cavities prior to in situ hybridization
Minuten pins 0.2mm diam		Fine Science Tools	26002-20	Keep pins together using a magnetic stirrer;
Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base	Reagent	Dow Corning	0001986475	Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C
Diethylpyrocarbonate (depc)	Reagent	Acros Organics	10025025	Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave
16% PFA	Reagent	Electron Microscopy Sciences	15710
Tween-20	Reagent	Sigma	P1379-100ML
Proteinase K		Sigma	P2308-5MG	Stock at 10 mg/ml in depc-H2O in 10ul aliquots. Store at -20C.
Formamide, deionized	Reagent	Ambion	9342
Yeast tRNA-25 mg	Reagent	Invitrogen	15401-011	Stock at 20 mg/ml in depc-H2O in 125ul aliquots. Store at -20C
Heparin Sodium salt	Reagent	Sigma	H4784-250MG	Stock at 50 mg/ml in depc-H2O in 100ul aliquots. Store at -20C.
SSC x20 pH5.5	Reagent	Fisher	PR-V4261
EDTA (0.5M)	PR-V4231	Fisher
SDS	Reagent	Fisher	BP166-100
Maleic acid	Reagent	Fluka	63189
Boehringer Blocking Reagent	Reagent	Roche Applied Sciences	11096176001	Use at 2% in MABT. To make, heat with MABT for 20 mn at 60C. Can make a stock and store in 1-5 ml aliquots at 20C.
Heat inactivated sheep serum	Reagent	Jackson Immuno	013-000-121	Dissolve in 10 ml H2O; heat 550C, 30 mn. Aliquot at 1ml, -20C.
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments	Reagent	Roche Applied Sciences	11093274910
NBT/BCIP stock solution	Reagent	Roche Applied Sciences	11681451001
Anti-Fluorescein-AP, Fab fragments	Reagent	Roche Applied Sciences	11426338910
2M Tris	BP1759-500	Fisher
Vector Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit	Reagent	Vector Laboratories	SK-5100
1,2,3,4-tetrahydronaphthalene	Reagent	Sigma	429325-100ML	Under hood