Monte doble entero hibridación in situ de embriones de pollo temprano
Summary
Este video muestra a 2 colores montar toda la hibridación in situ, un método por el cual el patrón de expresión espacial y temporal de dos genes diferentes se pueden visualizar en embriones de pollo joven. Este método fue introducido originalmente por David Wilkinson, Henrique Domingos, Ingham Phil y David Ish-Horowicz.
Abstract
El embrión de pollo es una herramienta valiosa en el estudio del desarrollo embrionario temprano. Su transparencia, accesibilidad y facilidad de manipulación, lo hacen una herramienta ideal para estudiar la expresión génica en el cerebro, tubo neural, somite y la formación de primordios corazón. Este video muestra los diferentes pasos en el monte de 2 colores toda la hibridación in situ, En primer lugar, el embrión se diseca del huevo y se fijaron en paraformaldehído. En segundo lugar, el embrión se procesa para prehibridación. El embrión se hibrida con dos sondas diferentes, una junto a la DIG, y un acoplado a FITC. Tras la hibridación noche a la mañana, el embrión se incuba con anticuerpo acoplado DIG. Reacción de color de sustrato DIG se lleva a cabo, y la región de interés se ve azul. El embrión se incuba con anticuerpos FITC acoplados. El embrión se procesa para la reacción de color con FITC, y la región de interés se ve rojo. Finalmente, el embrión se fija y se procesaron para phtograph y seccionamiento. Una guía de solución de problemas también se presenta.
Protocol
Discussion
Todo el monte de 2 colores en el método de hibridación in situ se utiliza para determinar los patrones espaciales y temporales de la expresión génica, utilizando uno o dos genes de interés. Las aplicaciones incluyen la evaluación de patrones de expresión génica de los genes de la novela (por ejemplo, 1,2, así como los cambios en la expresión génica insulto siguientes (manipulaciones embrionarias 3, 4 bolas, y la electroporación de ARN o ADN construye 5).
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Margaret M. Alkek a RHF.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Eggs | Animal | Charles River | Premium Fertile | |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 | |
| Marsh Automatic Incubator | Tool | Lyon | RX | |
| Hybridization Incubator | Tool | Hybaid | Micro-4 | |
| Adams Nutator orbital mixer | Tool | Fisher | 14-062 | |
| Curved Forceps (1) | Tool | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Fine scissors | Tool | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Spoon | Tool | Fine Science Tools | 10370-18 | |
| Pasteur Capillary Pipette | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | ||
| Microcapillary tube | Sigma | P1049-1PAK | Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps | |
| Microdissecting knife | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to puncture cavities prior to in situ hybridization | |
| Minuten pins 0.2mm diam | Fine Science Tools | 26002-20 | Keep pins together using a magnetic stirrer; | |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Reagent | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Reagent | Acros Organics | 10025025 | Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave |
| 16% PFA | Reagent | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Tween-20 | Reagent | Sigma | P1379-100ML | |
| Proteinase K | Sigma | P2308-5MG | Stock at 10 mg/ml in depc-H2O in 10ul aliquots. Store at -20C. | |
| Formamide, deionized | Reagent | Ambion | 9342 | |
| Yeast tRNA-25 mg | Reagent | Invitrogen | 15401-011 | Stock at 20 mg/ml in depc-H2O in 125ul aliquots. Store at -20C |
| Heparin Sodium salt | Reagent | Sigma | H4784-250MG | Stock at 50 mg/ml in depc-H2O in 100ul aliquots. Store at -20C. |
| SSC x20 pH5.5 | Reagent | Fisher | PR-V4261 | |
| EDTA (0.5M) | PR-V4231 | Fisher | ||
| SDS | Reagent | Fisher | BP166-100 | |
| Maleic acid | Reagent | Fluka | 63189 | |
| Boehringer Blocking Reagent | Reagent | Roche Applied Sciences | 11096176001 | Use at 2% in MABT. To make, heat with MABT for 20 mn at 60C. Can make a stock and store in 1-5 ml aliquots at 20C. |
| Heat inactivated sheep serum | Reagent | Jackson Immuno | 013-000-121 | Dissolve in 10 ml H2O; heat 550C, 30 mn. Aliquot at 1ml, -20C. |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Reagent | Roche Applied Sciences | 11093274910 | |
| NBT/BCIP stock solution | Reagent | Roche Applied Sciences | 11681451001 | |
| Anti-Fluorescein-AP, Fab fragments | Reagent | Roche Applied Sciences | 11426338910 | |
| 2M Tris | BP1759-500 | Fisher | ||
| Vector Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit | Reagent | Vector Laboratories | SK-5100 | |
| 1,2,3,4-tetrahydronaphthalene | Reagent | Sigma | 429325-100ML | Under hood |
References
- Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation. Nature. 406, 74-78 (2000).
- Rodríguez Esteban, C., Capdevila, J., Economides, A. N., Pascual, J., Ortiz, A., Izpisúa Belmonte, J. C. The novel Cer-like protein Caronte mediates the establishment of embryonic left-right asymmetry. Nature. 401, 243-251 (1999).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen’s node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
- Kawakami, M., Nakanishi, N. The role of an endogenous PKA inhibitor, PKIalpha, in organizing left-right axis formation. Development. 128, 2509-2515 (2001).
- Basch, M. L., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. I. Specification of the neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7. Nature. 441, 218-222 (2006).
