Overview
ソース: ドクターペッパー イアン博士チャールズ Gerba - アリゾナ大学所
示す著者: ブラッドリー ・ シュミッツ
菌類従属栄養の真核生物、酵母を除いて好気性。表層土壌に豊富な栄養循環での役割と有機物や有機汚染物質の分解にとって重要です。白腐病菌 (チグ chryosporium) たとえば、(図 1) は、芳香族化合物を低下させる知られています。
図 1。ホワイト ・ バーチ材の腐敗。
Principles
土壌は通常土は通常希釈系列を使用して希釈されるのでグラムあたり、菌の数百万を含んでいます。希釈系列は、脱イオン水など、分散ソリューションの土壌の一定の中断によって行われます。懸濁液の採取、寒天上に成長する個々 の離散真菌のコロニーを許可するように十分に懸濁液を希釈するまで新鮮なソリューションに転送されます。(図 2)
25 ° C でプレートに孵化するいくつかのレプリケート寒天プレートに接種後巨視的真菌植民地が形成された後彼らがカウントされます、図 3に示すように。前提は真菌のコロニーは用語のコロニー形成単位(CFUs) 1 つの有機体から派生した 1 つがオーブン乾燥土壌 1 g CFUs の面で表される結果と最終的な分析で使用されます。
肥沃な土壌から通常の培養菌数は、106-106真菌「繁殖体」(胞子や菌糸、菌糸のフラグメント) 乾燥土壌 1 g 範囲にあります。培養プレート カウントは、19 世紀以来の生物を列挙するに使用されています。簡単と、かなり再現実行、少し労働力を必要とする高価ではないため、今日使用され続けます。しかし、彼らはいくつかのエラーは、結果を評価する際に考慮する必要があります苦しむか。これらのエラーの最も重要なは、多くの生物、文化メディア プレートのない事実です。
図 2。希釈とメッキ技術。ここでは、希釈土壌懸濁液を寒天培地に直接組み込まれてなく表面拡散メッキの場合と同様に適用されます。環境 & 汚染科学、2nd 編、学術出版物、サンディエゴ、カリフォルニア州
図 3。ローズ ベンガル寒天を含むペトリ皿の成長表面の土壌から分離した糸状菌を土壌します。写真提供: k. l. ジョセフソン。環境 & 汚染科学、2nd 編、学術出版物、サンディエゴ、カリフォルニア州。
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Procedure
1. 土壌サンプルの準備
- まず、一晩の湿った土の量は、既知の乾燥と乾燥土壌を計り直しによって土の初期含水率を決定します。土の初期含水率を決定する式です。
(関係式 1)
どこ：
MC = 水分
W = 重量
D = 乾燥重量 - 土壌水分乾燥重量ベースで 10% を増加する土の 25 g に追加しなければならない水の量を計算します。
- 次に、土の 25 g に水の量を追加します。
- プラスチック製のラップのコンテナーをカバーし、潜伏中に通気できるようにプローブを数回フィルムに穴をあけます。ゴムのバンドが付いているフィルムを固定します。
- 土の重量を量る、ラップし、一週間室温でサンプルをインキュベートします。
2. 菌接種と培養
- 孵化が完了したら、ラップと輪ゴムで土のサンプルの重量を量る。水分の損失による体重の減少を計算します。
- 新しい土壌含水率を計算します。
- 次に、図 2に示すように、土の 1/10 希釈系列を調製します。これは 10 の-5 (チューブ E) g 土壌懸濁液 mL あたり、10-4 (D 管)、10-3 (C 管) 10-2 (チューブ B) 10-1 (ボトル A) の希釈液になります。
- 寒天滅菌ローズ ベンガル ストレプトマイシンを準備します。ローズ ベンガルおよびストレプトマイシンの両方は、細菌の増殖を抑制します。非常に肥沃な土壌は、土壌微生物の個体数が多いの選ばれた希釈が高くすべきすなわち、10-3、-410、10-5、プレートごと土壌 g。
- 10-3の各プレート、希釈チューブ 10-2、0.1 mL を追加し、エタノール炎を用いた寒天培地の表面に広がって滅菌ガラス スプレッダー。0.1 mL の量をメッキすると、ために、効果的な希釈 10-3。すべての希薄のためには、この手順を繰り返します。
- 1 週間板室温で孵化させなさい。
3. コロニーを数えると顕微鏡による検討
- 各土壌の 1 つと 1 つだけの希釈でコロニー カウントを確認します。数えられるプレート控えめな可算植民地が必要です。草に覆われたプレートをカウントされませんする必要があります。同様に、未満 10 植民地板はカウントされませんする必要があります。注意してください、3 つの異なる植民地の文化的な特性を記述します。
- 次の手順を使用して詳細な顕微鏡に関する圧力 (透明テープ) マウント スライドを準備します。
- きれいなガラス スライドの中央に流体をマウント葉身のドロップを入金します。
- セロハン テープのストリップをカット素材のロールから約 3 cm 長い。テープの粘着面が汚れない、テープの処理時に鉗子を使用します。解剖針は鉗子からテープを解放に役立ちます。
- テープの接着面は、基部の菌コロニーの表面に適用されます。テープまたは菌糸の塊も高密度に過度の圧力を避けるために世話をして胞子が収集されます。
- 菌のコロニーが付いている接触からテープを削除し、液をスライド ガラスに取付のドロップ ダウン、それは、粘着面を適用します。特急気泡に滑らかで平ら楽器でテープを優しくこする。
- 油で油浸対物レンズの顕微鏡下のテープのマウントを確認します。
- 指定された真菌の同定のキー (図 4) を使用して 2 つの異なる真菌属を識別します。
図 4。真菌の同定のキー。
糸状菌は、真核多細胞生物の生態系で重要な役割を果たして、土壌に大量によく見られます。菌の分離、定量化、および実験結果からできます。
菌は表層土壌で豊富であり、栄養循環と有機物や汚染物質の分解に重要な役割を果たします。自分の食べ物を合成することができない彼ら従属栄養として分類され、好気性が、したがって酸素を必要とします。
文化菌類、土壌サンプルは、滅菌水の中に既知の濃度で希釈した寒天プレートの上にメッキし、培養します。結果真菌のコロニーをカウントし、識別可能性があります。
このビデオは分離、定量化、および糸状菌の同定の背後にある原理を説明します。
土壌は一般にグラム; あたりの菌の数百万を含んでいます。したがって、シリアル希釈、分析用土壌試料を準備する使用されます。一定量の土壌は、分散ソリューションに追加されます。懸濁液の因数はシリーズの緩衝液に転送される懸濁液を希釈するまで成長する離散真菌コロニーを許可するのに十分な。
これらの希釈は寒天培地上にメッキし、培養します。彼らは、表示されている真菌のコロニーを形成している、数えることができます。各真菌のコロニーが単一の有機体から派生することと、乾燥した土壌の 1 グラムあたり計算生物の数を表現するコロニー形成単位、または CFU の用語は使用します。
ほとんどの真菌は菌糸は、長い、生長する成長の主なモードは、構造を分岐として成長します。菌糸の集計は、菌糸体と呼ばれます。菌がよく知られている例である酵母単一の単細胞生物としてまた存在します。
真菌の繁殖は、いくつかの方法のいずれかで発生します。菌糸生産糸状菌は菌糸、断片化することによってまたは種子のような胞子茎から無性、再現できます。単細胞の菌類は、出芽による無性生殖可能性があります。
菌も性的に再現できます。これは無性生殖よりより少なく共通、通常好ましくない環境条件への応答で発生します。菌糸生産異なる菌株からの 2 つの生殖菌糸で定着が可能、菌類、接合を作成します。単一の単細胞菌類では反対側系統の 2 つのセルを結合します。
肥沃な土壌は、通常 106真菌「繁殖体」の乾燥重量 1 グラムあたりの範囲に含まれます。繁殖体は真菌の胞子、菌糸や菌糸破片です。培養プレート カウントを使用して、真菌の内容を明らかにする、安価で、迅速かつ再現性のある手法です。しかし、結果はすべての生物、文化メディア プレートの事実によって傾けることもできます。
ローズ ベンガル寒天、ストレプトマイシンなどの抗生物質と通常、真菌培養に使用されます。細菌はほとんど土壌中の菌類よりもずっと数が多いので、理想的な真菌メディアは、生き残るために菌類を許可している間細菌の増殖に対して選択されます。ローズ ベンガルの染料はほとんどの細菌の成長を抑制して真菌のコロニーのサイズが小さくなります。これは、理想的な真菌プレートとして制御する細菌の増殖を防ぐことができます。
今では私たちは糸状菌を培養の原理に精通している、どのように研究室で実施していますでみましょう。
土壌サンプルが収集されると、分析の研究室にそれらをもたらします。まず、土の水分量を計算します。含水率を 15% にもたらすに脱イオン水を加えます。
ラップで容器をカバーし、蒸発量を制限するゴムバンドで固定します。通気できるように映画の数回を穿刺します。
土壌サンプルおよびコンテナーとレコードの重量を量る。自然に発生する菌類の成長を許可する 1 週間室温で孵化させなさい。
再土壌試料とコンテナーの重量を量る、重量を記録します。今週の水分の損失による体重の減少を計算します。重量を元の値に戻すため、土壌に水を追加します。
95 mL の蒸留水に湿った土の 10 g を加え、徹底的に混ぜます。これは 10-1希釈土壌 10 g には約 5 mL のボリュームです。この原液から水を使用して 9 mL 空白に 1 mL の 4 つのシリアル希薄を実行します。
次に、8 つの滅菌ローズ ベンガル ストレプトマイシン寒天プレートを収集します。プレートの 2 つ、希釈チューブ 10-2、0.1 mL を追加し、エタノール火炎滅菌ガラス拡散機を使用して寒天培地の表面に広がってください。0.1 mL の量をメッキすると、ために、効果的な希釈 10-3。
1 週間常温で暗いキャビネット内のこれらの版を孵化させなさい。
1 週間後各プレートの離散のコロニーをカウントします。10 に 20 真菌植民地板をカウントすべき。メモし、板や植民地の特徴的な機能について説明します。
きれいなガラス顕微鏡スライドを取るし、葉身中央に流体をマウントのドロップを入金します。汚染を避けるために鉗子を使用してセロハン テープ長さ約 3 cm のストリップをカット.必要に応じて、鉗子からテープを解放するのに解離性の針を使用します。
過大な圧力を避けるために世話基部の菌コロニーの表面にテープの粘着面を適用します。次に、スライド ガラスに取り付け流体に胞子サンプル テープの接着面を適用されます。空気の泡を削除する滑らかな、フラット楽器でテープを優しくこする。
ハイパワー目的の下のテープのマウントを確認します。
菌類は子実体や胞子の検査によって顕微鏡で識別できます。菌同定のキーはこのプロセスを支援することができます。アオカビ、コウジカビなど一般的な菌の種類を観察。
プレートを使用すると、菌は細菌の列挙と同じテクニックを使用して列挙されます。
識別し、菌を培養、さまざまな科学的なアプリケーションに役立ちます。
パルプおよびペーパー生産施設のような産業は、木材パルプのプロセス、biopulping として知られている技術の分解に糸状菌を使用できます。白色腐朽などの真菌は化学または機械パルプの使用の減少の必要性につながる効率的に木材チップを低下可能性があります。
特定の種類の生分解性プラスチックなど他の材料を分解する菌類を使用もできます。これは不要な植物の成長への一時的な障壁を作成する生分解性マルチ フィルムを利用できる農業または園芸用に便利することができます。
菌は、抗生物質、20 世紀の医学に革命をもたらしました、今日の感染症の最前線の防衛であり続ける化合物の生産者がいます。広く使用されている抗生物質のペニシリンが一般的な糸状菌ペニシリウム ルーベンスから分離されました。この日には、糸状菌はまだ分離し、新しい抗生物質のための検索で勉強します。
糸状菌のゼウスの概要を見てきただけ。今土壌糸状菌を培養する方法、それらを数値化する方法、土壌中の菌の種類を識別する方法を理解する必要があります。見てくれてありがとう!
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Results
コロニー カウント
土のグラム当たりの真菌のコロニー数コロニー メッキ希釈の逆数によって乗算プレート カウント数と同じです。たとえば、10-5の希釈で、46 のコロニーがカウントされる場合、土壌 1 g CFU は 46 × 105または 4.6 x 106。
3 つの異なる菌属の同定
菌類は子実体や胞子の検査によって顕微鏡で識別できます。菌同定のキーはこのプロセスを支援することができます。(図 4)アオカビ、コウジカビなど一般的な菌の種類を観察。
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Applications and Summary
希釈して土壌菌類のめっきは、土壌の健康の指標として使用できます。通常「健康」肥沃な土壌、10 を持って5土のグラム当たり 10 の6菌。それは、純粋培養の有機化合物を低下させる能力など、特定のプロパティの評価その後特定の菌を分離するため利用できます。これらは白色腐朽菌の場合と同様に有害であることができるまたはとき有毒な有益な有機物は分解によって劣化が。菌の純粋培養の他の用途には、抗生物質の糸状菌の分離が含まれます。たとえば、最初の抗生物質はペニシリン、土壌病菌ペニシリウムこれまでだった。これは最初に先生によって発見されました。1929 年にアレクサンダー ・ フレミング。
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References
- Pepper, I.L., Gerba, C.P., Brusseau, M. Environmental & Pollution Science, 2nd Ed. Academic Press, San Diego, CA. (2006).
- Pepper, I.L., Gerba, C.P. Environmental Microbiology, A Laboratory Manual, 2nd Ed. Academic Press, Boston, MA. (2005).
