Overview
ソース: ドクターペッパー イアン博士チャールズ Gerba - アリゾナ大学所
示す著者: ルイーザ Ikner
土壌内の微生物群集の解析の従来の方法は通常どちらかの文化の試金希釈の利用と選択的な差動媒体または直接カウントの試金の方法論をめっきを関与しています。直接カウントは存在する細菌の総数に関する情報を提供が、数や人口の地域内に存在の多様性についての情報を与えない。プレート カウントは、文化全体の列挙または選択した文化集団、したがって別の集団の存在に関する情報を提供します。しかし、土壌細菌の 1% 未満は容易に培養可能なので文化情報は画像の一部だけを提供します。培養できるコミュニティの実際の割合は、文化カウント中の選択に依存します。1 つのメディアは、特定の媒体に最適です集団の選択されます。
近年、土壌サンプルから抽出したコミュニティ DNA を学ぶメリットが明らかになります。この nonculture ベースのアプローチは文化ベースのアプローチよりもより実際のコミュニティの存在の代表と考えられています。現在人口の種類についての情報を提供することに加えてこのアプローチはまた彼らの遺伝的潜在能力について情報を提供できます。あらゆる技術と DNA の抽出で得ることができるデータには制限があります。したがって、多くの研究者は環境サンプルから得られたデータを最大限に今直接、文化的なカウントと共に DNA の抽出を使用します。
Principles
土壌からの DNA 抽出は、(表 1) の 2 つの方法のいずれかで実施できます。その場観察法、化学をベースと機械技術の組み合わせが使用されます。この抽出のため土の質量は等価抽出バッファー量と組み合わされます。ガラス製のビーズ、洗剤のボリュームと一緒にペンションに追加されます (ドデシル硫酸ナトリウム、または SDS を使用通常)、セル換散を促進するために高温で土壌粒子からの分離を容易にする、サンプルをブレンド。遠心分離後 DNA 製品を浄化するためにそれ以上の抽出と培養の手順に上澄みは服従します。
代わりに、最初のセルが遺伝物質の抽出の前に土のマトリックスから分別 (または分離)。土壌試料の質量を受ける連続サイクルのブレンドそしてゆっくりと遠心分離。ビーズ ステップはペレットを取得する, そのまま細胞を維持するためにここでは、ただし、除去されます。リゾチームを用いた抽出が細胞壁を破壊し、浄化のための DNA を解放するインキュベーションと組み合わせて実行されます。
この手順は、細胞分画法の土壌サンプルから DNA の濃度をもたらす実証されているようこの原稿、ビデオは土壌からの DNA の抽出の場観察法を実演します。
| 問題 | 細菌分別 | その場で換散 |
| DNA の収量 | 1-5 μ g/g | 1-20 μ g/g |
| コミュニティの代表者 | 細胞吸着のため以下の代表 | 代表的な影響を受けない細胞吸着 |
| 回復 DNA のソース | 細菌だけ | また菌類、原生動物、細菌主 |
| DNA のせん断の程度 | 小さいせん断 | せん断の詳細 |
| DNA のフラグメントの平均サイズ | 50 kb | 25 kb |
| 腐植の汚染度 | 少ない汚染 | 汚染より |
| 方法論の使いやすさ | 低、骨の折れる | 速くより少なく労働集約的です |
表 1.土壌からの DNA の回収のため細菌分別とその場で溶解方法の比較。
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Procedure
1. 細菌群集の DNA の抽出
- 手順を開始するには、ふるわれた土壌の 100 グラムを重量を量る。ポリプロピレン容器にこれを追加し、100 mL の Tris バッファーは土壌マトリックスからの細菌の放出を促進し、手で振る EDTA と改正から成る抽出バッファーを追加します。
- 次に、ガラス玉の 100 g の重量を量るし、混合容器にこれらを追加します。デバイスや、混合物を 15 分追加 10 mL 20% ドデシル硫酸ナトリウム、または SDS のメカアクション手首シェーカーを破ってビーズを使用して 5 分間サンプルを扇動し、追加分のために振といます。60 分の 60 から 65 ° C の高温で孵化させなさい。
- 同様に別の 50 mL チューブの中でサンプルを配布し、6,000 x g. で 10 分間遠心は単一の滅菌コンテナーにチューブから上澄みを転送します。次に、抽出バッファーの新鮮なボリュームを使用して、上記のとおり土壌ペレットに抽出を繰り返します。
- 次に、ボリュームも半分に満ちている 30% ポリエチレング リコールと 1.6 M 塩化ナトリウムの解決策クリーン 50 mL チューブに処理された上澄み、約 200 mL の容量を追加します。ミックスするボトルの数回を手で反転し、DNA をペレットに 20 分間、10,000 × g で遠心分離機サンプル 2 のため室温で孵化させなさい。
- 部分精製核酸の餌を残して、遠心分離機管から上澄みを慎重に削除します。20 mL TE バッファーの渦、ペレットを再懸濁しますに 7.5 M カリウム酢酸溶液 1.5 mL を追加します。タンパク質と多糖類の沈殿物に 4 ° C で 30 分間 16,000 x g で 5 分遠心分離機氷の懸濁液を場所します。
- 次に、RNAse とプロテイナーゼ K をサンプルに追加する、手でやさしく混ぜて、しばらく放置します。抽出してミックスする懸濁液にフェノール: クロロホルム: イソアミル アルコール (25:24:1 の比率の混合物) の相当量を追加そっと手で。遠心分離機 13,000 x g に 10 分のための準備は、遠心分離機、注 2 つのレイヤーから船を慎重に取り外します。
- 下、重い層フェノール: クロロホルム: イソアミル アルコールで構成されています、破片を抽出し、最上位のレイヤーは水性 DNA が含まれています。滅菌容器に水相を配置、イソプロパノールの相当量を追加して、DNA の沈殿物を開始する優しく反転します。30 分は上澄みを慎重に取り外しますと小球形にされた DNA 可能性がありますまたは可能性がありますいない容器の下部に表示される 1 mL の TE バッファーで、再懸濁しますの 16,000 × g で遠心分離によって常温 2 h. ペレット精製 DNA の懸濁液を孵化させなさい。
- 分光光度計または DNA ・ RNA 定量蛍光を使用して、サンプルから抽出した DNA のレベルを測定します。DNA の量は 260 nm 読書から推定されます。1.0 の吸読書、DNA 溶液の mL あたり 50 μ g に相当します。濃度が正確な測定値の高すぎる場合希釈懸濁液 10 を 1 または 100 に 1 分子レベルの水を使用します。
- 260 で読書の割合から推定される DNA の純度を 280 nm nm。値 > 1.7 比較的純粋な DNA を示します。最大理論値は 2.0 です。
細菌群集の DNA の抽出は、コミュニティ内で複数の菌種から DNA を得シングル抽出処理中にプロセスです。
土壌における微生物群集の伝統的な分析は通常文化試金、希釈を利用と異なる選択的メディア論をめっきを関与しています。しかし、多くの細菌は実験室の条件の下でまたは逃したまたは深刻な過小評価可能性がありますように選択すると、特定の成長メディア条件に不十分に成長します。
最近では、細菌の土壌サンプルから dna のコミュニティは細菌群集のより包括的なサンプリングの許可されています。この非文化に基づく伝統文化ベースの方法よりもより実際の社会の現在の代表と考えられています。
このビデオは、DNA の抽出の細菌群集の非培養法を実演します品質と抽出された DNA の量をチェックし、この DNA が細菌の多様性を研究に利用する方法を探索する方法。
土壌からの DNA の抽出は、2 つの方法のいずれかで実施できます。分別法で細胞はまず遺伝物質の抽出の前に土のマトリックスから区切られます。サンプルがゆっくりとブレンドの連続のサイクルにさらされて、そのまま細胞ペレットを収集するために遠心分離。
リゾチームは、細胞に添加し、懸濁液を培養します。リゾチームは、細菌の細胞壁を分解する酵素です。細胞壁構造が侵害された後、DNA が解放されて浄化のため。ただし、大きい DNA 濃度をもたらすコミュニティ DNA の抽出、その場でメソッドの 2 番目の方法を示されています。
ここでは、土壌の質量がトリス EDTA 抽出バッファーとガラス製のビーズの量と組み合わされて、土壌粒子からの細胞分離を容易にするために積極的に混合。洗剤が追加されます、一般的にサンプルや SDS、ドデシル硫酸ナトリウム、さらにブレンド細胞と DNA を含む彼らの内容のリリースの溶解を促進します。
任意の残りの細菌細胞を溶解する高温孵化をうけるし。サンプル、遠心分離、. ペレットに遠心し、DNA を沈殿させるために上澄みポリエチレング リコール抽出と培養を実行します。
DNA は TE バッファーで再停止されるし、さらに酢酸カリウムを洗うタンパク質や多糖類、DNA、これらの好ましくない成分をペレットに遠心分離を実施します。DNA を含む水溶液上澄みが削除され、さらにクリーンと DNA を集中するフェノール-クロロホルム抽出とイソプロパノール沈殿物を受けます。2 時間の部屋の温度の潜伏期間では、DNA は遠心分離、分析までストレージの TE バッファーで再停止されます。
今では私たちは概念と細菌群集の DNA の抽出の背後にあるプロセスに精通している、それは実験室で実施はどのように見てをみましょう。
手順を開始するには、ふるわれた土壌の 100 グラムを重量を量る。ポリプロピレン容器にこれを追加し、100 mL の Tris バッファーは土壌マトリックスからの細菌の放出を促進し、手で振る EDTA と改正から成る抽出バッファーを追加します。
次に、ガラス玉の 100 g の重量を量るし、混合容器にこれらを追加します。デバイスやメカアクション手首シェーカーを破ってビーズを使用して 5 分間サンプルを揺り動かしなさい。10 mL 20% ナトリウム dodecyl 硫酸塩、または SDS を混合物に追加し、追加分の扇動します。60 分の高温孵化させなさい。
同様に別の 50 mL チューブの中でサンプルを配布し、6,000 x g. で 10 分間遠心は単一の滅菌コンテナーにチューブから上澄みを転送します。次に、抽出バッファーの新鮮なボリュームを使用して、上記のとおり土壌ペレットに抽出を繰り返します。
次に、ボリュームも半分に満ちている 30% ポリエチレング リコールと 1.6 M 塩化ナトリウムの解決策クリーン 50 mL チューブに処理された上澄みの容量を追加します。ミックスするボトルの数回を手で反転し、DNA をペレットに 20 分間、10,000 × g で遠心分離機サンプル 2 のため室温で孵化させなさい。
部分精製核酸の餌を残して、遠心分離機管から上澄みを慎重に削除します。20 mL TE バッファーの渦、ペレットを再懸濁しますに 7.5 M カリウム酢酸溶液 1.5 mL を追加します。タンパク質と多糖類の沈殿物に 4 ° C で 30 分間 16,000 x g で 5 分遠心分離機氷の懸濁液を場所します。
次に、RNAse とプロテイナーゼ K をサンプルに追加する、手でやさしく混ぜて、しばらく放置します。抽出してミックスする懸濁液にフェノール: クロロホルム: イソアミル アルコールの量を追加そっと手で。遠心分離機 13,000 x g に 10 分のための準備は、遠心分離機、注 2 つのレイヤーから船を慎重に取り外します。
下、重い層フェノール: クロロホルム: イソアミル アルコールで構成されています、破片を抽出し、最上位のレイヤーは水性 DNA が含まれています。滅菌容器に水相を配置、イソプロパノールの相当量を追加して、DNA の沈殿物を開始する優しく反転します。30 分は上澄みを慎重に取り外しますと小球形にされた DNA 可能性がありますまたは可能性がありますいない容器の下部に表示される 1 mL の TE バッファーで、再懸濁しますの 16,000 × g で遠心分離によって常温 2 h. ペレット精製 DNA の懸濁液を孵化させなさい。
分光光度計または DNA ・ RNA 定量蛍光を使用して、サンプルから抽出した DNA のレベルを測定します。DNA ・ RNA fluorimeters ミリリットルあたりナノグラム単位で DNA レベルが出力されます。濃度が正確な測定値の高すぎる場合希釈懸濁液 10 を 1 または 100 に 1 分子レベルの水を使用します。
細菌群集から得られた DNA は、一度これはいくつかの異なる方法で利用できます。これらのアプリケーションのいくつかはここで検討されています。
写真コミュニティ DNA から抽出した DNA の解析は、指定された土壌サンプルで現在の細菌のセルの数への洞察力を提供できます。ソリューションの mL あたり ng の DNA の量は土壌の g あたり DNA の合計量を与えるソリューションでは、抽出した DNA 量に戻って関連付けることができます。細胞 1 個あたりの DNA の理論値を知ること、土壌の g ごとのセルの合計数を計算できます。
ターゲットを絞ったアプリケーション、特定の種が地域内に存在かどうかを pcr 細菌群集から抽出した DNA を受けることができます。たとえば、科学者は、土壌試料にウェルシュや炭疽など特定の病原体が含まれているかどうかを識別する必要があります。
最後に、コミュニティで現在の細菌のより包括的な理解を得るためには、DNA のサンプルはサンプル内の元の細菌のより深い分析を可能にする「弔」、バイオ情報の評価を受けることができます。"Omics"では、役割、関係、および分子生物やコミュニティの行動を探る技術の範囲について説明します。これは、遺伝子の研究とそれらの機能、または「ゲノミクス」および「プロテオミクス」タンパク質の研究とそのロールが含まれています。たとえば、サンプルからの 16S RNA の配列は特定の種の多様性のより詳細な見積もりを与えるコミュニティ内のメタゲノム定量を許可できます。このアプローチは、コミュニティの種構成の理解を深める科学者を与えることができると約束される可能性がどのような役割。
ちょうど細菌群集の DNA の抽出にゼウスの導入を見た。今、細菌群集から DNA を抽出する方法、この DNA の品質を確認する方法および細菌群集組成の調査のためのこの DNA の使用方法を理解する必要があります。見てくれてありがとう!
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Applications and Summary
コミュニティから DNA 培養コロニーまたはから抽出された土壌は、サンプル内の元の細菌の特徴を可能にするバイオインフォマティクスと「弔」方法を受けることができます。本腰を入れてアプローチにはメタゲノミクス-16S rRNA 配列を介してコミュニティの中で「誰が」の判定であるが含まれます。これは、コミュニティ内での多様性の推定値を与えます。
元の土壌サンプルの細菌のセルの数を計算することも。コミュニティ DNA は土壌から抽出された、分光学的解析によって量を示されます。推定量の DNA 溶液の mL あたり μ g DNA として測定土壌の g あたり総額 DNA を与える解決策の抽出 DNA の総容積に関連しています。細胞 1 個あたりの DNA の理論値を知ることによって、土壌の g ごとのセルの合計数を計算できます。
例
土壌には土壌の g あたり 0.12 μ g DNA
各セルに 4 DNA の fg
コミュニティ抽出した DNA は、特定の種が地域内に存在かどうかに特異的プライマーを用いた PCR 解析を受けることができます。ウェルシュや炭疸菌など細菌病原体特定があります。
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