CRISPR Cas9을 이용한 자연살해세포의 유전자 편집 기법

CRISPR RNA 또는 crRNA와 트랜스 활성화 crRNA 또는 tracrRNA의 혼합물을 섭취하십시오.

혼합물을 가열하고 식혀서 tracrRNA와 crRNA의 염기 쌍을 촉진하여 가이드 RNA 또는 gRNA를 형성합니다.

gRNA에 결합하여 복합체를 생성하는 Cas9 효소라는 분자 가위를 추가합니다.

Cas9-gRNA 복합체를 전기천공 용액에 현탁된 자연 살해 또는 NK 세포에 첨가합니다.

Cas9-gRNA 복합체 수송을 돕는 단일 가닥 DNA 분자를 도입합니다.

혼합물을 큐벳으로 옮기고 전기천공을 수행하여 복합체가 세포에 들어갈 수 있도록 막에 임시 기공을 만듭니다.

gRNA는 게놈의 표적 부위에 결합하여 Cas9가 DNA를 절단할 수 있도록 합니다.

복구 단백질은 절단 부위에서 결합하여 DNA에 결합하여 종종 염기쌍 삽입 또는 결실 오류를 일으킵니다. 그 결과 변형은 표적 유전자를 파괴하여 기능을 없게 만듭니다.

추가 분석을 위해 유전자 변형 세포를 적절한 배지로 옮깁니다.

전기천공 당일, 실험 세포 조건당 IL-2 밀리리터당 100IU가 보충된 8밀리리터의 신선한 배양 배지로 T25 플라스크 1개를 채우고, 플라스크를 섭씨 37도 및 5%_CO2 인큐베이터에 넣습니다.

배지가 평형을 이루는 동안 조건당 3 내지 4 x 10⁶ 세포, 26마이크로리터의 형질도입 혼합물을 원추형 튜브에 추가하고 원심분리에 의해 세포를 펠릿화합니다. 그런 다음 세척당 12밀리리터의 멸균 PBS로 세포를 세 번 세척하여 세포 현탁액에서 모든 FBS를 제거합니다.

세포를 세척하는 동안 각 CRISPR RNA 및 추적자 RNA를 200마이크로몰 최종 농도로 재현탁합니다. 각 CRISPR RNA 2.2마이크로리터를 샘플당 200마이크로몰 부피의 추적자 RNA 1개와 혼합하고 샘플을 섭씨 95도에서 5분 동안 가열합니다. 그런 다음 샘플을 실온으로 식히고 CRISPR RNA - 추적자 RNA 복합체를 사용할 때까지 섭씨 음하 20도에서 보관합니다.

리보핵단백질 복합체를 형성하기 위해, Cas9 엔도뉴클레아제를 적절한 상응하는 CRISPR RNA-추적자 RNA 복합체에 30 내지 60초에 걸쳐 소용돌이치면서 첨가하고, 생성된 Cas9 리보핵단백질 복합체를 실온에서 15 내지 20분 동안 배양한다.

마지막 세척 후, Nucleofector 용액 P3 키트에서 전기천공 보충제의 전체 부피를 추가하고 기포를 피하도록 주의하면서 P3 1차 4D-Nucleofector 용액 20마이크로리터에 각 세포 펠릿을 재현

리보핵단백질 복합체 5마이크로리터를 적절한 세포 현탁액에 즉시 첨가하고, 1마이크로리터의 100마이크로몰 Cas9 전기천공 강화제를 Cas9 리보핵단백질 복합체 세포 혼합물에 첨가한다. 26마이크로리터의 Cas9 리보핵단백질 세포 용액을 Nucleocuvette 스트립의 개별 웰에 옮기고 스트립을 가볍게 두드려 샘플이 각 웰의 바닥을 덮도록 합니다.

그런 다음 4D-Nucleofector 시스템 EN-138 프로그램을 시작합니다. 형질도입이 끝나면 세포를 3분 동안 그대로 둡니다. 그런 다음 사전 평형화된 배양 배지 80마이크로리터를 각 큐벳에 추가하고 섭씨 37도 배양에서 조건당 하나의 플라스크에 샘플을 부드럽게 옮깁니다.