카본 블랙 잉크의 혈관 재관류은 뇌 혈관의 신뢰성 시각화 수 있습니다

이 절차의 전반적인 목표는 재현 가능한 방식으로 마우스의 대뇌 혈관 해부학적 구조를 연구하는 것입니다. 먼저, 대뇌 혈관을 유색 라텍스로 염색하여 나중에 카본 블랙 잉크 염색과 비교합니다. 다음으로, 카본 블랙 잉크를 혼합하고 동물에 P-B-S-P-F-A 및 카본 블랙 잉크 혼합물을 좌심실을 통해 관류합니다.

마지막 단계에서는 뇌를 채취하고 염색된 뇌혈관을 비교하고 분석하기 위해 사진을 찍습니다. 궁극적으로 이미지 J 소프트웨어는 중대뇌동맥과 전대뇌동맥 사이의 문합점을 분석하는 데 사용됩니다. 이 기술의 의미는 뇌혈관 질환, 특히 혈관 밀도와 혈관 신생을 분석하는 데 사용할 수 있기 때문에 뇌혈관 질환 치료로 확장됩니다.

이제 이 방법은 뇌의 혈관 시스템에 대한 통찰력을 제공할 수 있으며 심장, 간 또는 신장의 미세 혈관을 시각화하는 것과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. EP 튜브에 라텍스와 카본 블랙 잉크를 결합한 후 수조에서 섭씨 37도에서 혼합물을 데웁니다. 23-25 게이지 바늘을 사용하여 2 밀리리터 주사기에 따뜻하게 데운 라텍스를 모으십시오.

그런 다음 12.5mg의 파핀 하이드로 클로라이드 분말을 1 밀리리터의 멸균 생리 식염수에 용해시키고 와류 후 생성 된 용액을 인슐린 주사기에 수집합니다. 다음으로, 다른 멸균 인슐린 주사기의 바늘을 떼어내고 분리된 바늘을 20cm 길이의 PE 10 튜브 끝에 놓습니다. 그런 다음 PE 10 튜브를 Papine 염산염 용액이 들어 있는 인슐린 주사기의 바늘에 부착합니다.

이제 인슐린 주사기 2개에 식염수 1ml를 더 채운 다음 모든 주사기와 멸균된 해부 기구를 마취 전 수술 단계로 가져갑니다. 마우스의 무게를 잰 다음 지속적으로 마취된 마우스를 등에 눕힙니다. 팔다리를 고정하고 왼쪽 대퇴 정맥 위의 피부를 자릅니다.

이제 대퇴 정맥을 찾아 PE 10 튜브에 연결된 바늘 끝을 삽입합니다. 그런 다음 Papine 염산염 용액을 분당 약 100 마이크로 리터의 속도와 체중 1kg 당 50 밀리그램의 용량으로 천천히 주입합니다. 주사 후 복강을 절개한 다음 횡격막을 뚫습니다.

그런 다음 갈비뼈를 잘라 심장을 노출시키고 하행 흉부 대동맥을 동맥 겸자로 클립합니다. 다음으로, 정맥혈을 배출하기 위해 오른쪽 심방을 날카롭게 자릅니다. 그런 다음 좌심실에 식염수 2ml를 주입합니다.

Profil 용액 또는 결합된 잉크 혼합물에 공기가 존재하면 뇌의 혈관 영역이 염색되지 않을 수 있습니다. 성공을 위해 모든 주사기에 기포가 전혀 없는지 매우 주의 깊게 확인하십시오. 이제 미리 채워진 주사기의 내용물을 18-20 초 동안 유색 라텍스를 수동으로 주입하기 위해 차례로 부드럽게 투여하고 동물을 5 분 동안 그대로 두십시오.

그런 다음 동물의 목을 베인 후 피질이나 혈관 구조를 손상시키지 않도록 주의하면서 두개골 뼈와 수막을 제거한 다음 조심스럽게 뇌 전체를 채취합니다. 6-8 밀리리터의 4% PFA가 들어 있는 60mm 세포 배양 접시에 뇌를 넣은 다음 작동 현미경에 부착된 카메라를 사용하여 접시 아래에 측정 자를 놓습니다. 현미경 대물렌즈와 페트리 접시 사이의 90도 각도에서 뇌의 등쪽과 복부 표면을 25배 확대하여 사진을 찍습니다.

원래 거리를 정량화하려면 100마이크로리터 분취량 2개(herts stemple farba 잉크 또는 CB 1)를 펠리칸 스크ribal 슈워츠 잉크 900마이크로리터 분취량 2개와 혼합하거나 CB 2를 2개의 별도 1.5ml EP 튜브에 혼합하여 카본 블랙 잉크 염색 절차를 시작합니다. 잉크 혼합물을 1밀리리터 인슐린 주사기 두 개에 모읍니다. 그런 다음 주사기의 뚜껑을 닫고 섭씨 37도의 수조에 각각 1ml의 식염수가 들어 있는 다른 인슐린 주사기 2개와 함께 넣습니다.

방금 시연한 대로 마우스를 처리한 후 약간의 압력을 사용하여 두 개의 카본 블랙 잉크 용액을 밀리리터당 18-20초에 걸쳐 좌심실에 주입합니다. 방금 시연한 대로 뇌를 제거하고 사진을 찍은 후 뇌를 4% PFA에 하룻밤 동안 넣은 다음 떠다니는 뇌가 완전히 잠길 때까지 자당 농도를 점차적으로 증가시키는 배양합니다. 일과성 국소 뇌허혈을 유도하여 이 단계를 시작합니다.

중대뇌동맥의 내강내 폐색의 표준 프로토콜에 따르면, 재관류 기간이 끝나면 방금 설명한 대로 CB 1 및 CB 2 잉크로 혈관 구조를 염색한 다음 섭씨 37도에서 5-10분 동안 2% TTC 용액으로 전체 뇌를 염색합니다. 경색 부피를 확인하기 위해 경색 부위는 흰색으로 유지되는 반면 허혈되지 않은 부위는 빨간색으로 바뀝니다. 대뇌 혈관의 전체적인 해부학적 구조를 분석하기 위해 방금 설명한 대로 이미지를 수집하려면 먼저 뇌의 얼룩진 표면의 이미지를 엽니다.

이미지 J 소프트웨어를 사용하면 유색 라텍스로 관류된 뇌가 복부 표면에 위치한 다양한 정도의 혈관 염색을 나타낼 수 있습니다. CB one plus CB 2 관류는 복부와 등쪽 표면의 모든 혈관을 염색합니다. 눈금을 밀리미터 단위로 설정하고 전대뇌동맥 또는 CA와 중대뇌동맥 또는 MCA 사이의 문합점을 표시하여 이러한 모든 문합점을 연결하는 가상의 선을 만듭니다.

이제 문합선과 정중선 사이의 거리를 4에서 측정한 다음 뇌의 전두극까지 6mm를 측정합니다. 동물당 3-4개의 이미지를 분석한 후 평균값을 계산합니다. 뇌혈관 해부학적 구조 내의 차이를 식별하기 위해 서로 다른 동물 그룹 간의 값을 비교합니다.

C 57 black six J 동물에서 a CA와 MCA 사이의 문합선은 전두극에서 6mm보다 4mm에서 정중선에 더 가깝게 추적될 수 있는 반면, APO 지단백 e 녹아웃 마우스는 이 점에서 큰 차이를 나타내지 않습니다. 대조적으로, SV 1 29 마우스의 문합선은 혈관 해부학적 분석을 위해 전두극에서 4mm와 6mm 모두에서 정중선과 점점 더 평행하게 놓여 있습니다. 허혈성 상태에서 경색 경계는 대사 활성 조직을 나타내는 빨간색과 흰색 조직 가장자리로 식별하고, 괴사 조직은 각각 뇌의 전두극에서 정중선에서 4mm와 6mm 코들에서 경색 경계의 거리를 측정합니다.

여기에 설명된 프로토콜은 설치류 대뇌 혈관 구조의 기존 라텍스 기반 시각화의 기술적 한계를 극복합니다. 이 첫 번째 이미지는 유색 라텍스의 관류 후 보여주듯이 복부 표면의 큰 혈관만 염색되고 전체 등쪽 표면은 염색되지 않습니다. 반대로, CB 1 플러스 CB 2 관류는 작은 혈관과 큰 혈관 모두를 동일한 방식으로 충분히 충진합니다.

염색은 품질 변화없이 7 일 동안 안정적입니다. Image J 프로그램을 사용하여 정중선에서 A CA와 MCA 사이의 문합점의 거리를 잉크로 관류하여 국소 혈관 해부학의 차이를 평가한 모든 다른 마우스 그룹에서 분석할 수 있습니다. POE를 녹아웃하는 것은 C 57 black six J 마우스에서 대뇌 혈관의 해부학적 구조에 영향을 미치지 않지만, C 57 black six J 및 SV 1 29 균주 간에 상당한 차이가 있음을 알 수 있습니다.

실험용 설치류 뇌졸중 모델에서 TTC 염색은 경색 부피의 시각화에 널리 사용됩니다. CB one plus CCB two staining은 혈관 구조의 구조적 변화를 관찰하기 위한 허혈성 조건에서도 적용할 수 있으며 TTC staining과 결합할 때 높은 안정성을 보여줍니다. 주목할 점은, 뇌혈관의 동시적 시각화와 허혈성 뇌의 경색 부피(infarct volume)는 뇌허혈의 다른 기간과 재관류 시점에 의해 유도된다는 것입니다.

1일 또는 5일의 재관류 기간과 일치하는 허혈 45분 또는 90분 후 ac와 MCA 사이의 문합점을 분석한 결과, 예상대로 정중선과 문합점 간의 평균 차이는 그룹 간에 유의한 차이를 보이지 않았음을 보여줍니다. 또한, 평균 거리는 허혈성이 없는 동물과 동일한 범위에 있었습니다. 그러나 정중선에서 경색 경계까지의 거리는 그룹 간에 상당한 차이가 있으며, 이는 허혈 재관류 손상의 정도가 높을수록 경색 부피가 증가했음을 반영합니다.

이 기술은 실험적 뇌졸중 분야의 연구자들이 쥐 뇌의 혈관 영역을 탐구할 수 있는 길을 열어줄 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 느슨한 잉크 또는 카본 블랙 잉크로 뇌를 관류하여 쥐의 해부학적 구조인 뇌혈관을 연구하는 방법과 Image J 소프트웨어의 도움으로 염색된 뇌 조직을 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.