지질 나노 튜브에 혈액 응고 인자 VIII의 나선형 조직

이 절차의 전반적인 목표는 초저온 전자 현미경을 통해 지질 나노튜브에 조직된 VIII 인자 나선의 구조를 정의하는 방법을 보여주는 것입니다. 이는 먼저 지질 나노튜브에서 나선형 정제 인자 VIII를 구성하고 액체 질소 온도 및 낮은 전자 선량에서 초저온 전자 현미경 데이터를 수집하여 수행됩니다. 다음으로, factor VIII 멤브레인 결합 구조는 단일 입자와 나선형 3D 재구성 알고리즘을 결합하여 계산됩니다.

그런 다음 전자 단층 촬영 데이터를 수집하고 3D 재구성을 생성합니다. 궁극적으로 계산된 인자 VIII 지질 나노튜브 구조는 3D 부피를 분할하고 이를 단층 촬영 재구성과 비교하여 검증됩니다. 입증된 방법은 인자 VIII의 막 결합 조직이 무엇이며 응고에서 그 기능과 어떤 관련이 있는지와 같은 구조 생물학 및 혈액 응고 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

GM 2100 lab six에는 전자 현미경에 연결된 컴퓨터로 구성된 TE con 운영 체제가 장착되어 있습니다. 진공 시스템, 조명 시스템, HT 렌즈 전류를 읽는 창과 컬럼 양쪽에 배치된 좌우 2개의 패널, 빔 시프트, XY 노브 및 다기능 또는 청각 스틱 노브가 두 패널에 있는 스크린. 왼쪽 패널에는 조명 또는 밝기 노브가 있습니다.

오른쪽 패널에는 배율 및 초점 노브와 Mag One, Mag 2 및 Low Mag 이미징을 위한 3개의 버튼, 그리고 회절 모드를 위한 1개의 버튼이 있습니다. 이 프로토콜의 경우 일반 설정을 사용하여 알파 2에서 mag 1의 데이터를 획득합니다. 오른쪽 패널의 맨 윗줄에 있는 F1에서 F까지 6개의 버튼을 사용하여 cryo EM 데이터 수집에 필요한 최소 선량 조명 조건 또는 MDS를 설정합니다.

F1을 사용하여 화면을 올리거나 내리고, F를 사용하여 2를 사용하여 검색 모드를 선택하고 F를 3을 사용하여 초점을 맞춥니다. 사진 모드로 F 4를 선택하고, MDS를 끄거나 켜려면 F 5를 선택하고, 빔을 편향시켜 방사선 손상으로부터 표본을 보호하는 데 사용되는 빔 블랭크로 F 6을 선택합니다. cryo EM 샘플을 준비한 후 텍스트 프로토콜에 따라 cryo holder를 cryo station에 넣고 액체 질소로 홀더와 cryo station의 doer를 채웁니다.

온도가 섭씨 영하 192도에 도달하면 홀더 팁의 셔터를 열고 이전에 동결된 cryo EM 그리드를 지정된 위치에 놓고 링 클램프를 사용하여 고정합니다. 다음으로, 극저온 홀더를 전자 현미경에 삽입하고 액체 질소를 사용하여 극저온 홀더와 안티 에이터 챔버의 doer를 다시 채웁니다. 홀더가 30-60분 동안 안정화된 후 필라멘트를 켭니다.

필라멘트가 포화되면 F 6을 누르고 홀더의 셔터를 엽니다. 그리드를 보려면 낮은 mag alpha one을 누르고 그리드에서 얇은 얼음이 있는 영역을 찾습니다. 그런 다음 mag one alpha two로 전환하여 최소 선량 또는 MDS 모드를 설정하고 검체가 손상되지 않도록 낮은 전자 선량에서 cryo EM 데이터를 획득합니다.

선택 F 2 검색 모드를 설정하고 배율을 40, 000 x로 설정합니다. 밝기 노브를 사용하여 빔을 옹스트롬 제곱 곱하기 초 당 약 0.04 전자의 최소 전자 선량으로 확대합니다. 그런 다음 diff를 눌러 매그 캠 길이 노브로 회절 모드로 전환합니다.

카메라 길이를 120cm로 설정합니다. 그런 다음 미리 선택된 영역 내의 탄소 필름 구멍에 지질 나노튜브가 있는 그리드의 영역을 찾습니다. 다음으로, 40, 000의 x 확대에 사진 형태를 놓기 위하여 누르고, 옹스트롬 평방 시간 초 당 16에서 25의 전자의 복용량에 조명을 놓기 위하여 광도 손잡이를 이용하십시오.

그런 다음 표준 초점 버튼을 눌러 초점 조건을 설정하고 Z 업 다운 버튼으로 표본의 Z 높이를 조정하고 디포커스를 음수 1.5와 음수 2.5 마이크로미터 사이로 설정합니다. 사진 모드에서 이미지화할 영역에 해당하는 디지털 카메라 모니터의 라이브 뷰 창에서 검색 모드에서 사각형을 그려 검색과 사진 모드를 정렬하고 F를 세 번 눌러 초점 모드를 100, 000배 배율로 설정합니다. 그런 다음 CCD 칩을 덮도록 조명의 초점을 맞추고 이미지를 촬영할 영역을 조사하지 않도록 축을 벗깁니다.

사진 모드에서 디포커스를 네거티브 1.5와 네거티브 2.5 마이크로미터 사이에서 조정하여 필요한 경우 이미지의 난시를 수정합니다. 검색 모드에서 디지털 카메라 모니터 중앙의 라이브 뷰 창에서 라이브 이미지를 획득하여 이미지화할 F, 8, L, T를 라이브 뷰 창에 그려진 사각형의 F, 8, L, T를 선택합니다. 사진 모드로 전환하고 디지털 현미경 카메라 모니터에서 획득 버튼을 클릭합니다.

CCD 카메라에서 디지털 이미지를 기록하려면 CTRL F를 눌러 빠른 푸리에 변환을 얻어 획득한 이미지의 품질과 디포커스를 확인합니다. 무료 과학 이미징 처리 소프트웨어 인 Eman 2 및 I-H-R-S-R을 사용하여 텍스트 프로토콜에 따라 2D 이미지 분석 및 나선형 재구성을 수행 한 후. F 8 L 및 T 볼륨을 시각화하고 세그먼트화하기 위해 UCSF cera 선택 도구, 볼륨 데이터 세그먼트 맵에서 최종 3D 재구성을 열고 세그먼트 맵 탭에서 볼륨을 선택하고 세그먼트를 클릭하여 볼륨 데이터를 세그먼트화합니다.

그런 다음 control, shift, group을 차례로 클릭하여 하나의 단위 셀에 해당하는 세그먼트를 그룹화합니다. 구조적 특징을 강조하려면 작업 색상을 선택하여 단위 셀과 나선별로 세그먼트에 색상을 지정합니다. 전자 단층 촬영 데이터를 수집하기 위해 음으로 염색된 전자 현미경 그리드를 단일 틸트 홀더로 전송한 후 홀더를 전자 현미경 틸트로 전송합니다.

지질 나노튜브에 대한 일련의 동맹 조직화 돼지 인자 VIII를 직렬 EM 소프트웨어로 수집했습니다. 텍스트 프로토콜에 따르면, Tom은 IM에서 재구성되고 3D 모드로 시각화되어 imad bin Val tobin을 사용하기 위해 크기를 4 줄인 다음 IM mod rotate vol 명령을 사용하여 Y 축을 따라 지질 나노 튜브를 회전시키고 IM mod clip resize 명령 자르기로 전체 tommo를 회전시키는 적절한 각도를 선택합니다. Y축을 따라 선택한 지질 나노 튜브는 3D 모드를 사용하여 자른 sub tommo를 엽니다. 마지막으로, Tommo Graham을 클릭하여 Z축의 절편과 sub tomo 부피의 Y축을 따라 VII 인자 분자의 배열을 시각화합니다.

여기에서 볼 수 있듯이, 재조합 인간 및 돼지 F eights는 활성화된 혈소판 표면과 유사한 음전하를 띤 단일 이중층 lts에서 성공적으로 조직되었습니다. 이 그림은 인간과 돼지 F 8 및 최상의 대조군 LNT 및 F 8 LNT 2D 클래스 평균에서 막과 결합된 지질 이중층의 나선형 순서가 잘 정의되어 있음을 보여주며 두 단백질 사이의 나선형 조직의 변화를 보여줍니다. 이 패널은 최종 인간 및 돼지 F 8 L 및 T 데이터 세트에서 1000 개의 대표 입자로 수행 된 인간 및 돼지 F 8 L 및 T에 대한 초기 3D 재구성을 나타내며, 인간과 돼지 F 8 LNT에 대한 포어 쉘 상관 관계 플롯은이 그림에서 0.5와 동일한 푸리에 쉘 상관에서 20.5 옹스트롬의 해상도를 나타냅니다.

마지막 부피는 나선 축을 중심으로 조직된 8개의 인간 F 8 및 10 돼지 F 8 막 결합 분자를 보여줍니다. 각 인간 F 8 분자는 41.2 옹스트롬 이동되고 이전 분자에서 42.0도 회전하며, 각 돼지 F 8 분자는 최종 3D 재구성의 나선형 매개 변수에 해당하는 이전 분자에서 35.9 옹스트롬 및 35.2도 회전합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 지질 나노튜브에 동맹국으로 구성된 멤브레인 브라운 단백질의 초저온 전자 현미경 데이터를 획득하고 생리학적 조건에 가까운 3D 구조를 계산하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 비디오는 지질 환경에서 기능하는 다른 단백질에 적용할 수 있는 응고 단백질의 고해상도 멤브레인 결합 구조를 향한 첫 번째 단계입니다.