B 임파 세포 라인의 설립에 대한 간단한 적혈구 용해 방법

이 간단한 방법의 전반적인 목표는 소량의 혈액만을 사용하여 높은 불멸화 효율로 B 림프모구양 세포주(B-LCLs)를 구축하고, 개시부터 동결 보존까지의 시간을 단축하는 것입니다. 이는 적혈구를 용해함으로써 전혈로부터 인간 B 세포를 불멸화하는 새로운 방법입니다. B-LCLs는 다양한 연구를 수행하기 위한 귀중한 생물학적 재료 공급원이 됩니다.

이 방법의 주요 장점은 단 0.5 milliliters의 혈액만으로도 불멸화 효율과 높은 세포 생존율을 가진 B-LCL을 얻기에 충분하다는 것입니다. Epstein-Barr virus(EBV)로 B 림프구를 변형시켜 B-LCL을 확립하기 위해 널리 사용되는 방법은 Ficoll 밀도 구배 원심분리를 통해 말초혈액 단핵구(PBMC)를 개별적으로 분리하는 것입니다. 하지만 적혈구 용해물 샘플이 1 milliliter 미만일 경우, 첨가가 실패하게 됩니다.

우리는 밀도 구배 분리법을 사용하여 작은 적혈구로부터 PBMC를 분리하는 것이 어렵다는 점에 착안하여 이 방법의 아이디어를 처음 얻었습니다. EBV를 준비하기 위해, 1일 차에 B95-8 세포를 해동하고 10% FBS, 2 millimolar L-glutamine 및 항생제가 첨가된 6 mL의 완전 RPMI 1640 배지가 들어있는 T25 배양 플라스크에서 배양합니다. 배양물을 37 °C, 5% carbon dioxide 조건에서 배양합니다.

2일 차에 현미경으로 세포 형태를 관찰합니다. 세포가 밝고 둥근 모양이면 상태가 좋은 것입니다. 배양액에 complete RPMI 1640 Medium 10 milliliters를 첨가합니다.

4일 차에 10 milliliters의 신선한 배지를 첨가하고 세포를 T75 배양 플라스크로 옮깁니다. 그 후 8일 차에 배지 20 milliliters를 추가로 넣고 신선한 배지 첨가 없이 8일 동안 세포를 유지합니다. 16일 차에 현미경으로 세포를 확인합니다.

그런 다음 12 milliliters의 세포를 15 milliliter 원심분리 튜브에 수집합니다. 다음으로, 세포를 -80 degrees Celsius에서 한 시간 동안 냉동 보존한 후, 37 degrees Celsius에서 빠르게 해동합니다. 바이러스 입자가 세포에서 방출될 때까지 이 동결-해동 과정을 3회 더 반복합니다.

배양액을 실온에서 240 ×g로 10분 동안 원심분리하십시오. 그다음, 상층액을 0.22 micron 필터로 여과하십시오. 여과액을 튜브당 12 milliliters씩 분주하여 영하 80 degrees Celsius에서 보관하십시오.

50 milliliter 튜브에 EDTA K2로 항응고 처리된 전혈 0.5 milliliters를 넣습니다. 전혈에 적혈구 용해 버퍼 1 milliliter를 추가하고 잘 섞습니다. 혼합물을 실온에서 4분 동안 배양합니다. 그런 다음 1x PBS 5~7 milliliters를 빠르게 추가하여 용해 반응을 중단시킵니다.

혈액에 적혈구 용해 버퍼를 첨가한 후, 충분히 혼합하십시오. 도치 혼합을 통해 반응이 적시에 종료되도록 합니다. 그다음, 상온에서 240 ×g로 5분 동안 튜브를 원심분리하십시오.

백혈구가 튜브 바닥에 침전됩니다. 상층액을 버리고 1640 Basic Medium 7 mL를 첨가하여 침전물을 세척합니다. 그런 다음 용액을 원심분리하고 세척 과정을 반복합니다.

300 µL의 형질전환 배지를 사용하여 세포 펠릿을 재현탁합니다. 그 후 EBV 감염을 수행하기 위해, 세포 현탁액에 20 µg/mL 농도의 Cyclosporin A 60 µL를 첨가합니다. EBV 분注액을 37 °C에서 급속 해동한 후, 바이러스 240 µL를 세포에 첨가합니다.

현탁액을 충분히 혼합한 후 96-well 플레이트의 각 웰에 200 µL씩 분주합니다. 그 다음 플레이트를 37 °C, 5% CO2 조건에서 배양합니다. EBV 감염 후 첫 한 달 동안은 일주일에 한 번 세포 배양 배지의 절반을 교체합니다.

7일째에는 현미경 하에서 세포 파편의 두꺼운 층만 관찰됩니다. 감염 후 한 달이 지나면 세포 파편의 두꺼운 층 아래로 림프모구세포(lymphoblastoid cell) 클러스터가 보입니다. 이 시점부터 현미경으로 세포 클러스터가 명확하게 보일 때까지 3일마다 배지의 절반을 교체하십시오.

세포를 재현탁한 후, 현탁액을 24-well 플레이트의 웰로 옮깁니다. 그 후 세포 성장 속도에 따라 배양액이 노란색으로 변하면, 완전 RPMI 1640 배지의 부피를 두 배로 늘려줍니다. 림프모구 세포 군집이 육안으로 보일 때, 배양물을 T25 배양 플라스크로 옮깁니다.

배양액이 노란색으로 변하면, 배양액의 부피가 10~15 mL로 늘어날 때까지 배양액의 양을 두 배로 늘립니다. 동결 전 24시간 전에 배양액을 교체하십시오. 그 후 세포를 동결하기 위해 세포 현탁액을 원심분리하고 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 측정합니다.

90% FBS와 10% DMSO를 포함하는 동결 스톡 용액을 사용하여, 세포 현탁액의 밀도를 mL당 5~10 × 10⁶ cells로 조정합니다. 그런 다음 현탁액을 분당 1°C의 속도로 -80°C까지 냉각하여 동결시킨 후, 동결된 세포를 액체 질소에 직접 옮깁니다. 형질전환 과정 동안 세포의 형태학적 변화를 광학 현미경으로 관찰할 수 있습니다.

감염 후 7일이 지나면 밀도 구배 분리법을 사용했을 때는 작은 세포 클러스터가 뚜렷하게 관찰되는 반면, 적혈구 용혈법을 사용했을 때는 세포 파편의 두꺼운 층만 관찰됩니다. 감염 후 30일이 되면 세포 파편의 두꺼운 층 아래에서 림프모구 세포 클러스터가 관찰됩니다. 배지 교체 횟수를 늘리면 세포 파편이 감소하여 세포 클러스터가 명확하게 보이며, 이는 밀도 구배 분리법으로 구축된 배양 상태와 유사하게 보입니다.

마지막으로 MTT 분석을 사용하여 B-LCL의 생존능을 평가하였습니다. 여기에 제시된 결과는 적혈구 용해법을 사용하여 배양한 B-LCL 세포가 밀도 구배 분리법을 사용하여 구축한 배양 세포보다 생존능이 유의하게 더 높았음을 나타냅니다. EBV 바이러스 형질전환 과정은 숙달되어 적절하게 수행될 경우 30분 이내에 완료할 수 있습니다.

이 영상을 시청하고 나면, 림프구의 사전 정제 과정 없이 간단하고 시간을 절약할 수 있는 적혈구 용해법을 사용하여 B-LCL을 확립하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 기술의 개발 이후, EBV 관련 질환의 유전체학, 전사체학 및 단백질체학 연구와 단클론 항체 생산에 적용되는 속도가 가속화되었습니다. EBV와 같은 인체 병원체를 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으며, 이 절차를 수행하는 동안 항상 주의를 기울여야 한다는 점을 잊지 마십시오.