Elektrophoretische Mobilität Shift Assay (EMSA)
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개요
Die elektrophoretische Mobilität Shift-Assay (EMSA) ist eine biochemische Verfahren zur Bindung zwischen Proteinen und Nukleinsäuren zu erhellen. In dieser Probe eines radioaktiven Nukleinsäure und Protein Test gemischt. Bindung wird bestimmt durch Gelelektrophorese trennt Komponenten basierend auf Masse, Ladung und Konformation.
Dieses Video zeigt die Konzepte von EMSA und ein allgemeines Verfahren, einschließlich Gel und Protein Vorbereitung, Bindung, Elektrophorese und Erkennung. Anwendungen fallen in diesem Video sind die Analyse der Chromatin-Umbau Enzyme, eine modifizierte EMSA, die Biontinylation enthält und das Studium der Bindungsstellen der bakteriellen Antwort Regulierungsbehörden.
EMSA, elektrophoretische Mobilität-Shift-Test, auch bekannt als das Gel Schicht Assay, ist ein vielseitiger und sensible biochemische Verfahren. EMSA erläutert Bindung zwischen Proteinen und Nukleinsäuren durch eine Verschiebung in Bands in der Gelelektrophorese zu erkennen.
Dieses Video beschreibt die Prinzipien der EMSA, gibt ein allgemeines Verfahren, und einige Anwendungen diskutiert.
DNA-Replikation, Transkription, sowie Reparatur und RNA Verarbeitung sind alle wichtigen biochemischen Prozesse. Sie beinhalten alle Bindung zwischen Proteinen und Nukleinsäuren. Viele schwere Krankheiten und Störungen sind Änderungen in dieser Bindung zugeordnet. EMSA ist eine Technik für qualitativ zu bestimmen, ob ein bestimmtes Protein an einen spezifischen Nukleinsäure bindet. Erstens ist die Nukleinsäure in der Regel mit radioaktivem Phosphor-32, erstelle ich eine Sonde beschriftet. Dann werden die Test-Protein und Nukleinsäure-Sonde gemischt. Wenn ein Protein an einer Nukleinsäure-Sonde bindet, hat die daraus resultierende Komplex größere Masse und eine andere Konformation als die Nukleinsäure allein.
Einmal gebunden, die komplexe mit Gelelektrophorese analysiert. Bei dieser Technik zwingt ein elektrisches Feld Makromoleküle durch eine Gelmatrix zu migrieren. Die Komponenten zu trennen basierend auf Masse, Ladung und Konformation. Elektrophorese trennen vom ungebundenen Sonden Protein-DNA-komplexen. Da sie unterschiedlichen Massen und Konformationen haben, sie wandern durch das Gel mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten und trennen. Die Trennung ist leicht erkannt, dank der Anwesenheit von radioaktivem Phosphor, und beweist, dass das Protein bindet erfolgreich an die gegebene Nukleinsäure. Überprüfen Sie die Kennung des Proteins, verwendet ein “Supershift-Assay” einen Antikörper mit einer bekannten Affinität zum Protein. Dies hat den zusätzlichen Nutzen des weiteren Verschiebung der Komplex, Erhöhung der Auflösung.
Nun, da wir die Prinzipien gesehen haben, schauen wir es im Labor.
Um den Vorgang zu starten, muss das Protein isoliert werden. Hierzu werden molekularbiologische Techniken verwendet, um auszudrücken das Protein in den Zellen, und dann zu reinigen.
Die Nukleinsäure ist verstärkt und mit der Bezeichnung um eine Sonde zu erstellen. Kennzeichnung erfolgt durch Inkubation für 10 min mit dCTP mit radioaktivem Phosphor-32. Eine Strahlung-Safe Werkbank und Schutzausrüstung werden benötigt.
Das Gel ist dann bereit. Das Gel muss nicht-Denaturierung, um das Protein von Konformation zu verändern und potentiell Loslösen von der Sonde während der Elektrophorese zu verhindern. Polyacrylamid-Gele haben Porengrößen von 5 bis 20 nm und sind nützlich für kurze Sonden bis 100 Basenpaaren Länge. Agarose-Gele haben Porengrößen von 70 bis 700 nm und eignen sich für größere Sonden.
Mit dem Protein und Nukleinsäure-Sonde nun vorbereitet gehen wir auf die Bindung. Eine TRIS-Puffer-Lösung vorbereitet und das Protein und die Sonde werden hinzugefügt. Der pH-Wert sollte ähnlich wie physiologischen Bedingungen und Salzkonzentration ausreichen, um verhindern, dass das Protein bilden schwache Bindungen mit Nichtziel-Nukleinsäuren. Die Reaktion verläuft für 20-30 min bei 4 ° C.
Der nächste Schritt ist die Elektrophorese. Ein Puffer geringer Ionenstärke und einem pH-Wert ähnlich wie bei der Bindung-Reaktion wird genutzt. Es ergibt sich eine “festsetzende Wirkung”, die komplexe stabilisiert, erhöht die Mobilität und reduziert die Wärmeentwicklung. Nach Elektrophorese werden die Komponenten des Gels auf Filterpapier übertragen. Das Filterpapier ist in einem dunklen Raum dann Film ausgesetzt. Wenn das Protein an die Sonde bindet, werden zwei verschiedene gekennzeichnete Regionen bei der Übertragung angezeigt. Für die Anlage, und ein separates repräsentieren die ungebundene Sonde. Die Trennung zeigt, dass das Protein erfolgreich an die Nukleinsäure gebunden.
Nun, da wir die grundlegende Vorgehensweise gesehen haben, betrachten Sie einige Anwendungen.
Chromatin ist der dicht gepackten Komplex von DNA und Proteinen gefunden eukaryotische Zellen. Chromatin-Umbau Enzyme verändern die Struktur die DNA, Transkription zu öffnen. Da dadurch die Mobilität des Komplexes ist EMSA einsetzbar zu bindende Aktivität des Enzyms zu erkunden.
Ein alternativer Ansatz zur Kennzeichnung nutzt die Wechselwirkung zwischen DNA und die Methyltransferase Enzym. Ein Cofaktor kann geändert werden, um dauerhaft über Methyltransferase an DNA binden. Anstatt die Markierung mit Phosphor-32, der Cofaktor konjugiert, Biotin, was vorteilhaft ist, weil es nicht radioaktiv ist. Da der Cofaktor ortsspezifische in seiner Anlage ist, ist es relevant für Genotypisierung, Methylierung Erkennung und gen-Lieferung. Die Biotinilated-Nukleinsäuren werden durch ultraviolette Fluoreszenz erkannt.
Wenn Reize aus der Umwelt Histidin-Kinasen aktivieren, ist ein “Response Regulator” phosphoryliert. Dies bindet wiederum an DNA, die Transkription, die von EMSA studiert werden kann. Zum Beispiel zeigte sich ein Antwort-Regler in Desulfovibrio Vulgaris binden an das gen des Interesses. EMSA wurde verwendet, um sicherzustellen, dass die Bindung stattgefunden hat.
Sie haben genau beobachtete sie JoVE die elektrophoretische Mobilität-Shift-Test video an. Sie sollten jetzt ihre Prinzipien der Betrieb, die Schritte in das Verfahren und seine wichtigsten Betriebsparameter verstehen.
Danke fürs Zuschauen!
Procedure
Disclosures
내레이션 대본
EMSA, the electrophoretic mobility shift assay, also known as the gel shift assay, is a versatile and sensitive biochemical procedure. EMSA elucidates binding between proteins and nucleic acids by detecting a shift in bands in gel electrophoresis.
This video describes the principles of EMSA, provides a general procedure, and discusses some applications.
DNA replication, transcription, and repair, as well as RNA processing are all critical biochemical processes. They all involve binding between proteins and nucleic acids. Many serious diseases and disorders are associated with modifications in this binding. EMSA is a technique for qualitatively determining whether a specific protein binds to a specific nucleic acid. First, the nucleic acid is labeled, usually with radioactive phosphorus-32, to create a probe. Then the test protein and nucleic acid probe are mixed. When a protein binds to a nucleic acid probe, the resulting complex has greater mass and a different conformation than the nucleic acid alone.
Once bound, the complexes are analyzed with gel electrophoresis. In this technique, an electric field forces macromolecules to migrate through a gel matrix. The components separate based on mass, charge, and conformation. Electrophoresis can separate protein-DNA complexes from unbound probes. Since they have different masses and conformations, they will migrate through the gel at different rates and separate. The separation is easily detected, thanks to the presence of the radioactive phosphorus, and proves the protein successfully binds to the given nucleic acid. To verify the identification of the protein, a “supershift assay” uses an antibody with a known affinity to the protein. This has the added benefit of further shifting the complex, increasing resolution.
Now that we’ve seen the principles, let’s see it in the lab.
To begin the procedure, the protein must be isolated. To do this, molecular biology techniques are used to express the protein in cells, and then purify.
The nucleic acid is amplified and labeled to create a probe. Labeling is done through incubation for 10 min with dCTP containing radioactive phosphorus-32. A radiation-safe workbench and protective equipment are required.
The gel is then prepared. The gel needs to be non-denaturing, to prevent the protein from altering conformation and potentially unbinding from the probe during electrophoresis. Polyacrylamide gels have pore sizes of 5 to 20 nm and are useful for short probes up to 100 base pairs in length. Agarose gels have pore sizes of 70-700 nm and are useful for larger probes.
With the protein and nucleic acid probe now prepared, we proceed to binding. A TRIS buffer solution is prepared and the protein and probe are added. The pH should be similar to physiological conditions, and salt concentration sufficient to prevent the protein from forming weak bonds with non-target nucleic acids. The reaction proceeds for 20-30 min at 4 °C.
The next step is electrophoresis. A buffer of low ionic strength and a pH similar to that used in the binding reaction is utilized. It yields a “caging effect” that stabilizes complexes, increases mobility, and reduces heat generation. After electrophoresis, the components of the gel are transferred onto filter paper. In a dark room, the filter paper is then exposed to film. If the protein binds to the probe, two distinct labeled regions will be visible in the transfer. One representing the complex, and a separate one representing the unbound probe. The separation demonstrates that the protein successfully bound to the nucleic acid.
Now that we’ve seen the basic procedure, let’s look at some applications.
Chromatin is the tightly packed complex of DNA and proteins found eukaryotic cells. Chromatin-remodeling enzymes modify the structure to open the DNA to transcription. As this changes the mobility of the complex, EMSA can be used to explore the binding activity of the enzyme.
An alternate approach to labeling takes advantage of the interaction between DNA and the methyltransferase enzyme. A cofactor can be modified to bind permanently to DNA via methyltransferase. Rather than labeling with phosphorus-32, the cofactor is conjugated to biotin, which is advantageous because it’s not radioactive. Because the cofactor is site-specific in its attachment, it’s relevant to genotyping, methylation detection, and gene delivery. The biotinilated nucleic acids are detected through ultraviolet fluorescence.
When environmental stimuli activate histidine kinases, a “response regulator” is phosphorylated. This in turn binds to DNA, affecting transcription, which can be studied by EMSA. For instance, a response regulator in Desulfovibrio vulgaris was demonstrated to bind to the gene of interest. EMSA was used to verify that the binding took place.
You’ve just watched JoVE’s video on the electrophoretic mobility shift assay. You should now understand its principles of operation, the steps in its procedure, and its major operating parameters.
Thanks for watching!
