Saggio di spostamento della mobilità elettroforetica (EMSA)
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개요
Il test di spostamento della mobilità elettroforetica (EMSA) è una procedura biochimica utilizzata per chiarire il legame tra proteine e acidi nucleici. In questo test vengono miscelati un acido nucleico radiomarcizzato e una proteina di prova. Il legame è determinato tramite elettroforesi su gel che separa i componenti in base a massa, carica e conformazione.
Questo video mostra i concetti di EMSA e una procedura generale, tra cui la preparazione di gel e proteine, il legame, l’elettroforesi e il rilevamento. Le applicazioni trattate in questo video includono l’analisi degli enzimi rimodellanti la cromatina, un EMSA modificato che incorpora la biontinilazione e lo studio dei siti di legame dei regolatori della risposta batterica.
EMSA, il test di spostamento della mobilità elettroforetica, noto anche come test di spostamento del gel, è una procedura biochimica versatile e sensibile. EMSA chiarisce il legame tra proteine e acidi nucleici rilevando uno spostamento delle bande nell’elettroforesi su gel.
Questo video descrive i principi dell’EMSA, fornisce una procedura generale e discute alcune applicazioni.
La replicazione, la trascrizione e la riparazione del DNA, così come l’elaborazione dell’RNA sono tutti processi biochimici critici. Tutti coinvolgono il legame tra proteine e acidi nucleici. Molte malattie e disturbi gravi sono associati a modifiche in questo legame. L’EMSA è una tecnica per determinare qualitativamente se una proteina specifica si lega a uno specifico acido nucleico. In primo luogo, l’acido nucleico viene etichettato, di solito con fosforo-32 radioattivo, per creare una sonda. Quindi la proteina di prova e la sonda dell’acido nucleico vengono miscelate. Quando una proteina si lega a una sonda di acido nucleico, il complesso risultante ha una massa maggiore e una conformazione diversa rispetto al solo acido nucleico.
Una volta legati, i complessi vengono analizzati con elettroforesi su gel. In questa tecnica, un campo elettrico costringe le macromolecole a migrare attraverso una matrice di gel. I componenti si separano in base a massa, carica e conformazione. L’elettroforesi può separare i complessi proteina-DNA dalle sonde non legate. Poiché hanno masse e conformazioni diverse, migreranno attraverso il gel a velocità diverse e separate. La separazione è facilmente rilevabile, grazie alla presenza del fosforo radioattivo, e dimostra che la proteina si lega con successo all’acido nucleico dato. Per verificare l’identificazione della proteina, un “test supershift” utilizza un anticorpo con un’affinità nota alla proteina. Ciò ha l’ulteriore vantaggio di spostare ulteriormente la risoluzione complessa e crescente.
Ora che abbiamo visto i principi, vediamolo in laboratorio.
Per iniziare la procedura, la proteina deve essere isolata. Per fare questo, le tecniche di biologia molecolare vengono utilizzate per esprimere la proteina nelle cellule e quindi purificare.
L’acido nucleico viene amplificato ed etichettato per creare una sonda. L’etichettatura viene effettuata attraverso l’incubazione per 10 minuti con dCTP contenente fosforo-32 radioattivo. Sono necessari un banco da lavoro sicuro per le radiazioni e dispositivi di protezione.
Il gel viene quindi preparato. Il gel deve essere non denaturante, per evitare che la proteina alteri la conformazione e potenzialmente si slega dalla sonda durante l’elettroforesi. I gel di poliacrilammide hanno dimensioni dei pori da 5 a 20 nm e sono utili per sonde corte fino a 100 paia di basi di lunghezza. I gel di acarosio hanno dimensioni dei pori di 70-700 nm e sono utili per sonde più grandi.
Con la sonda proteica e dell’acido nucleico ora preparata, si procede al legame. Viene preparata una soluzione tampone TRIS e vengono aggiunte la proteina e la sonda. Il pH dovrebbe essere simile alle condizioni fisiologiche e la concentrazione di sale sufficiente per evitare che la proteina formi legami deboli con acidi nucleici non bersaglio. La reazione procede per 20-30 min a 4 °C.
Il prossimo passo è l’elettroforesi. Viene utilizzato un tampone di bassa resistenza ionica e un pH simile a quello utilizzato nella reazione di legame. Produce un “effetto intasamento” che stabilizza i complessi, aumenta la mobilità e riduce la generazione di calore. Dopo l’elettroforesi, i componenti del gel vengono trasferiti su carta da filtro. In una stanza buia, la carta da filtro viene quindi esposta alla pellicola. Se la proteina si lega alla sonda, nel trasferimento saranno visibili due distinte regioni etichettate. Uno che rappresenta il complesso e uno separato che rappresenta la sonda non legata. La separazione dimostra che la proteina si è legata con successo all’acido nucleico.
Ora che abbiamo visto la procedura di base, diamo un’occhiata ad alcune applicazioni.
La cromatina è il complesso strettamente imballato di DNA e proteine che si trovano nelle cellule eucariotiche. Gli enzimi rimodellanti la cromatina modificano la struttura per aprire il DNA alla trascrizione. Poiché questo cambia la mobilità del complesso, EMSA può essere utilizzato per esplorare l’attività di legame dell’enzima.
Un approccio alternativo all’etichettatura sfrutta l’interazione tra il DNA e l’enzima metiltransferasi. Un cofattore può essere modificato per legarsi permanentemente al DNA tramite metiltransferasi. Piuttosto che etichettare con fosforo-32, il cofattore è coniugato alla biotina, il che è vantaggioso perché non è radioattivo. Poiché il cofattore è sito-specifico nel suo attaccamento, è rilevante per la genotipizzazione, il rilevamento della metilazione e la consegna genica. Gli acidi nucleici biotinilati vengono rilevati attraverso la fluorescenza ultravioletta.
Quando gli stimoli ambientali attivano le istidina chinasi, un “regolatore di risposta” viene fosforilato. Questo a sua volta si lega al DNA, influenzando la trascrizione, che può essere studiata dall’EMSA. Ad esempio, è stato dimostrato che un regolatore di risposta in Desulfovibrio vulgaris si lega al gene di interesse. L’EMSA è stato utilizzato per verificare che il vincolo abbia avuto luogo.
Hai appena visto il video di JoVE sul test del turno di mobilità elettroforetica. Ora dovresti capire i suoi principi di funzionamento, i passaggi della sua procedura e i suoi principali parametri operativi.
Grazie per l’attenzione!
Procedure
Disclosures
내레이션 대본
EMSA, the electrophoretic mobility shift assay, also known as the gel shift assay, is a versatile and sensitive biochemical procedure. EMSA elucidates binding between proteins and nucleic acids by detecting a shift in bands in gel electrophoresis.
This video describes the principles of EMSA, provides a general procedure, and discusses some applications.
DNA replication, transcription, and repair, as well as RNA processing are all critical biochemical processes. They all involve binding between proteins and nucleic acids. Many serious diseases and disorders are associated with modifications in this binding. EMSA is a technique for qualitatively determining whether a specific protein binds to a specific nucleic acid. First, the nucleic acid is labeled, usually with radioactive phosphorus-32, to create a probe. Then the test protein and nucleic acid probe are mixed. When a protein binds to a nucleic acid probe, the resulting complex has greater mass and a different conformation than the nucleic acid alone.
Once bound, the complexes are analyzed with gel electrophoresis. In this technique, an electric field forces macromolecules to migrate through a gel matrix. The components separate based on mass, charge, and conformation. Electrophoresis can separate protein-DNA complexes from unbound probes. Since they have different masses and conformations, they will migrate through the gel at different rates and separate. The separation is easily detected, thanks to the presence of the radioactive phosphorus, and proves the protein successfully binds to the given nucleic acid. To verify the identification of the protein, a “supershift assay” uses an antibody with a known affinity to the protein. This has the added benefit of further shifting the complex, increasing resolution.
Now that we’ve seen the principles, let’s see it in the lab.
To begin the procedure, the protein must be isolated. To do this, molecular biology techniques are used to express the protein in cells, and then purify.
The nucleic acid is amplified and labeled to create a probe. Labeling is done through incubation for 10 min with dCTP containing radioactive phosphorus-32. A radiation-safe workbench and protective equipment are required.
The gel is then prepared. The gel needs to be non-denaturing, to prevent the protein from altering conformation and potentially unbinding from the probe during electrophoresis. Polyacrylamide gels have pore sizes of 5 to 20 nm and are useful for short probes up to 100 base pairs in length. Agarose gels have pore sizes of 70-700 nm and are useful for larger probes.
With the protein and nucleic acid probe now prepared, we proceed to binding. A TRIS buffer solution is prepared and the protein and probe are added. The pH should be similar to physiological conditions, and salt concentration sufficient to prevent the protein from forming weak bonds with non-target nucleic acids. The reaction proceeds for 20-30 min at 4 °C.
The next step is electrophoresis. A buffer of low ionic strength and a pH similar to that used in the binding reaction is utilized. It yields a “caging effect” that stabilizes complexes, increases mobility, and reduces heat generation. After electrophoresis, the components of the gel are transferred onto filter paper. In a dark room, the filter paper is then exposed to film. If the protein binds to the probe, two distinct labeled regions will be visible in the transfer. One representing the complex, and a separate one representing the unbound probe. The separation demonstrates that the protein successfully bound to the nucleic acid.
Now that we’ve seen the basic procedure, let’s look at some applications.
Chromatin is the tightly packed complex of DNA and proteins found eukaryotic cells. Chromatin-remodeling enzymes modify the structure to open the DNA to transcription. As this changes the mobility of the complex, EMSA can be used to explore the binding activity of the enzyme.
An alternate approach to labeling takes advantage of the interaction between DNA and the methyltransferase enzyme. A cofactor can be modified to bind permanently to DNA via methyltransferase. Rather than labeling with phosphorus-32, the cofactor is conjugated to biotin, which is advantageous because it’s not radioactive. Because the cofactor is site-specific in its attachment, it’s relevant to genotyping, methylation detection, and gene delivery. The biotinilated nucleic acids are detected through ultraviolet fluorescence.
When environmental stimuli activate histidine kinases, a “response regulator” is phosphorylated. This in turn binds to DNA, affecting transcription, which can be studied by EMSA. For instance, a response regulator in Desulfovibrio vulgaris was demonstrated to bind to the gene of interest. EMSA was used to verify that the binding took place.
You’ve just watched JoVE’s video on the electrophoretic mobility shift assay. You should now understand its principles of operation, the steps in its procedure, and its major operating parameters.
Thanks for watching!
