Perfil celular de alto rendimento de compostos de degradação de proteínas direcionadas usando linhas celulares CRISPR HiBiT

Essa abordagem permite o monitoramento celular da degradação de proteínas e a triagem rápida de compostos degradadores. A dinâmica da degradação pode ser monitorada em um contexto celular de maneira altamente sensível e quantitativa, permitindo a determinação precisa dos principais parâmetros de degradação. Esses métodos permitem o perfil HTS da atividade do composto degradador, permitindo a triagem na fase inicial de descoberta terapêutica.

Eles também fornecem informações para quem deseja estudar a modulação dos níveis-alvo endógenos, aumentando ou diminuindo. Demonstrando o procedimento estará Celia Bisbach, uma cientista pesquisadora em meu laboratório. Comece preparando e plaqueando células aderentes ou em suspensão de mamíferos.

Ajuste a densidade celular para 2,22 vezes 10 elevado à 5ª célula por mililitro e distribua-as em placas com um mínimo de três poços por condição experimental e de controle. Prepare PROTAC diluído em série, ou placas compostas de teste de degradador, na concentração de 1000x em 100% de DMSO. Em seguida, dilua-o até a concentração final de 10x no meio de cultura celular.

Adicione um volume igual de DMSO ao meio para criar um controle DMSO sem composto. Adicione a quantidade apropriada de composto 10x ou solução de controle às células da placa e incube as placas a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono. Para medir o sinal luminescente final, prepare 2x reagente de detecção lítica adicionando 20 microlitros de substrato lítico e 10 microlitros de proteína LgBiT para cada mililitro do tampão lítico.

Prepare reagente suficiente para todos os poços a serem analisados, incluindo volume extra para contabilizar o erro de pipetagem. Adicione o reagente de detecção lítico preparado às células e misture a placa em um misturador de vórtice de microplacas por 10 a 20 minutos a 350 RPM. Meça a luminescência em um luminômetro capaz de ler uma placa de 96 ou 384 poços.

Se estiver usando multiplexação de viabilidade celular, faça-o antes da adição do reagente lítico. 30 a 40 minutos antes da medição final desejada, prepare uma solução de reagente de detecção de viabilidade celular 6x adicionando 10 microlitros do substrato a dois mililitros do tampão de ensaio. Adicione o reagente preparado aos alvéolos e misture brevemente em um misturador de vórtice de microplacas.

Em seguida, incube a placa por 30 minutos em uma incubadora de 37 graus Celsius. No ponto final desejado, meça a fluorescência em um instrumento capaz de ler a fluorescência no formato de 96 ou 384 poços. Prepare 2x reagente lítico conforme descrito anteriormente.

Em seguida, adicione o reagente aos poços e misture a placa em um misturador de vórtice de microplacas por 10 a 20 minutos. Após a mistura, use um luminômetro para medir a luminescência. Para demonstrar a análise de degradação lítica de ponto final de concentração única, várias proteínas-alvo CDK foram marcadas endogenamente com HiBiT e tratadas com o PROTAC TL12-186 à base de pan quinase cereblon.

O nível de proteína CDK foi medido em diferentes momentos, e a RLU fracionada foi determinada. Para entender como as proteínas CDK se comparam diretamente entre si em termos de perda de proteína, as RLUs fracionárias foram calculadas como degradação percentual total. Uma análise de degradação cinética foi realizada marcando endogenamente proteínas de membros da família BET com células HiBiT e HEK293 expressando de forma estável a proteína LgBiT.

As células foram então tratadas com três concentrações diferentes dos PROTACs pan-BET. O dBET6 baseado em cereblon e o ARV-771 baseado em VHL. Os perfis cinéticos de degradação da resposta à dose de células Ikaros IKZF1-HiBiT CRISPR Jurkat expressando de forma estável a proteína LgBiT tratadas com quatro compostos de cola molecular diferentes são mostrados aqui.

Diferenças significativas na resposta de degradação entre os compostos, bem como ao longo da série de concentrações são observadas. Para avaliar quantitativamente a degradação e a ordem de classificação dos compostos, os perfis de resposta à dose foram usados para calcular os principais parâmetros de degradação, incluindo a taxa de degradação, o máximo de degradação e os valores de Dmax50. Os ensaios multiplex de viabilidade celular não mostraram perda na viabilidade celular para as concentrações testadas.

As etapas mais importantes neste protocolo são determinar a RLU fracionária ou a porcentagem de degradação por normalização para o controle DMSO. Seguindo este protocolo, pode-se realizar um ensaio fenotípico para entender como a perda de uma determinada proteína pode afetar a saúde ou a função celular. Além disso, essas linhagens celulares HiBiT também podem ser usadas para estudar interações proteicas ou ligação de pequenas moléculas usando a tecnologia NanoBETT.