세계 S. cerevisiae의에서 organelle 형태를 연구하기 위해 높은 처리량 방법

Summary

GFP – 퓨전 단백질은 널리 공촛점 현미경에 의해 organelles을 시각화하는 데 사용됩니다. 그러나, organelles의 형태에 영향을 변이에 대한 검사는 일반적으로 개별적인 돌연변이 유발이 필요하며 시간이 소요됩니다. 여기, 우리는 동시에 효모 거의 5000이 아닌 필수적인 유전자에 organelle – GFP 표식을 통합하는 방법을 보여줍니다.

Abstract

단백질 지방화 또는 organelle의 형태를 검사하기 위해 높은 처리량 방법은 단백질 상호 작용을 공부를위한 효과적인 도구이며 분자 경로의 포괄적인 이해를 얻을 수 있습니다. Saccharomyces의 cerevisiae에서 중요하지 않은 유전자 삭제 배열의 발달과 함께, 우리는 전세계 endoplasmic reticulum (ER)과 mitochondria 사용하여 GFP (또는 변형) – 마커 서로 다른 유전자 배경처럼 다른 organelles의 형태를 공부할 수 있습니다. 그러나, 각 단일 돌연변이에 결합 GFP 표식이 개별적으로 노동 집약적인 과정입니다. 여기, 우리는 정기적으로 저희 연구실에서 사용하는 절차를 설명합니다. 고밀도 효모 배열과 약물 선택 기법을 처리하는 로봇 시스템을 사용함으로써, 우리는 상당히 시간이 필요 단축 및 재현성을 향상시킬 수 있습니다. 간단한, 우리는 로봇 복제 달아하여 4,672 불필요한 유전자 삭제 돌연변이의 고밀도 배열 GFP – 태그 mitochondrial 마커 (Apc1 – GFP)을 교차. diploid 선택, sporulation, 발아 및 듀얼 마커 선택을 통해, 우리는 두 대립 유전자를 복구합니다. 결과적으로, 각 haploid 단일 돌연변이의 게놈 로커스에서 통합 Apc1 – GFP가 포함되어 있습니다. 이제, 우리는 모두 중요하지 않은 돌연변이 배경으로 mitochondria의 형태를 공부할 수 있습니다. 이 높은 처리량 접근 방식을 사용, 우리는 편리하게 연구와 게놈 전체 설정에서 상속 및 organelles의 형성에 관련된 경로와 유전자를 윤곽을 그리다 수 있습니다.

Protocol

재료 및 방법 : 효모 종자 : Acp1 – GFP (GFP : : 그의) : Acp1의 C – 말단 GFP – 태그는 플라스미드 pKT128을 (GFP 및 HIS5를 포함)를 사용하여 PCR – 중재 상동 재조합에 의해 생성되었다. 긍정적인 transformants은 공촛점 현미경과 식민지 PCR에 의해 확인되었다. 분 연구소 (통과 분, 2006)에서 : 스트레인 배경 BY7043 (STE2pr – lue2 lyp1Δ his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 MAT 알파 can1Δ)되었습니다. 삭제 ?…

Discussion

이 방법은 여러 가지 돌연변이 배경에 mitochondrial 마커, Acp1 – GFP를 통합할 효율적으로 도움이 될 수 있습니다. 그것은 로봇 시스템의 사용에 의존하고, 쉽게 어떤 로봇 시스템과 함께 사용하기 위해 채택 수 있습니다. 이 절차는 마커의 다른 유형을 통합 사용할 수 있습니다. 예를 들어, ER을 시각화하기 위해, 우리는 정기적으로 마커 Erg11 – GFP를 사용합니다. 우리의 대표 이미지, 돌연변이 및 Acp1 – GF…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
SGA media				The growth media (YPD) and synthetic dropout media (SD) including LRK and LHRK, and enriched sporulation media used in this protocol is routinely used in yeast molecular biology. Please refer to Methods in Yeast (Amberg et al., 2005) for detailed descriptions.