Identificação de complexos de proteínas com proteômica quantitativa em S. cerevisiae

Summary

Aqui nós descrevemos uma nova técnica proteômica quantitativa para a identificação de complexos de proteína em Saccharomyces cerevisiae. Neste estudo, nós utilizamos o método SILAC juntamente com purificação de afinidade seguido por espectrometria de massa para identificar com alta especificidade dos parceiros de ligação de uma proteína ER, Scs2p.

Abstract

Lipídios são os blocos de construção das membranas celulares que funcionam como barreiras e na compartimentalização de processos celulares e, recentemente, como importantes moléculas sinalizadoras intracelulares. No entanto, ao contrário de proteínas, lipídios são pequenas moléculas hidrofóbicas que o tráfego principalmente pelo mal descritos rotas não vesiculares, que são a hipótese de ocorrer em locais de contato da membrana (MCS). MCS são regiões onde o retículo endoplasmático (ER) faz o contato físico direto com uma organela parceria, por exemplo, membrana plasmática (PM). A porção de ER ER-PM MCS é enriquecida em lipídios, síntese de enzimas, sugerindo que a síntese lipídica é direcionado para esses sites e dando a entender que SMCs são importantes para o tráfego de lipídios. A levedura é um modelo ideal para estudar ER-PM SMCs por causa de sua abundância, com mais de 1.000 contatos por celular, e sua natureza preservada em todos os eucariontes. Descobrindo as proteínas que constituem MCS é fundamental para a compreensão de como o tráfego de lipídios é realizada nas células, e como eles agem como moléculas de sinalização. Descobrimos que uma ER chamado Scs2p localizar a ER-PM MCS e é importante para sua formação. Estamos focados em descobrir os parceiros moleculares da Scs2p. Identificação de complexos de proteínas tradicionalmente se baseia em primeiro resolver amostras de proteínas purificadas por eletroforese em gel, seguido por in-gel a digestão de bandas de proteínas e análise de peptídeos por espectrometria de massa. Isso muitas vezes limita o estudo a um pequeno subconjunto de proteínas. Além disso, complexos de proteínas são expostas a desnaturação ou condições não fisiológicas durante o procedimento. Para contornar esses problemas, temos implementado um grande escala técnica proteômica quantitativa para extrair dados imparciais e quantificados. Usamos rotulagem isótopo estável com aminoácidos em cultura de células (SILAC) para incorporar os núcleos de isótopos grampo em proteínas em uma estirpe de controlo untagged. Volumes iguais de cultura marcados e não marcados cultura, SILAC-rotulados são misturados e lisadas por moagem em nitrogênio líquido. Em seguida, realizar um processo de purificação de afinidade para puxar para baixo complexos de proteína. Finalmente, precipitar a amostra de proteína, que está pronto para análise por cromatografia líquida / espectrometria de massa tandem. Mais importante ainda, proteínas em uma estirpe de controlo são rotulados pela isótopo pesado e produzirá uma mudança em massa / carga que pode ser quantificado contra as proteínas não marcado na cepa isca. Portanto, contaminantes, ou ligação inespecífica pode ser facilmente eliminada. Usando essa abordagem, identificamos várias novas proteínas que localizar a ER-PM MCS. Aqui nós apresentamos uma descrição detalhada da nossa abordagem.

Protocol

Materiais e Métodos Cepas de leveduras Todas as cepas utilizadas neste estudo são baseados no fundo BY4742. Da estirpe do controlo SILAC (Mat a, his3, leu2, ura3, lys2 e arg4:: G418) foi feita por meio de cruzamentos arg4 tensão exclusão (Mat a, his3, ura3, leu2 e arg4:: G418) para BY4742 (Mat alfa, his3, leu2, ura3 e lys2), e as haplóides meióticas foram obtidas por dissecção tétrade. Portanto, a tensão de controle é um auxotroph de lisina e arginina. A…

Discussion

As alíquotas salvo durante o processo de purificação deve incluir (1) lisado celular pré-limpo, (2) fração ligada, (3) fracção livre, e (4) fração eluída. Recomendamos analisar o conteúdo de proteína das alíquotas acima por Western blotting utilizando anticorpo anti-TAP ou coloração pela prata para refletir a eficiência de ligação e eluição do experimento. Exemplos de um gel de prata manchada e uma mancha são mostrados na Figura 1.

Desde SILAC nos fornece medições imp…