S. cerevisiae, kantitatif proteomik protein kompleksleri tanımlanması

Summary

Burada Saccharomyces cerevisiae protein kompleksleri tanımlamak için yeni bir nicel proteomik tekniği açıklar. Bu çalışmada, yüksek özgüllük ile bir ER protein, Scs2p bağlayıcı ortakları tanımlamak için tandem kütle spektrometresi tarafından takip yakınlık arıtma ile birlikte SILAC yöntemi kullandık.

Abstract

Lipidler önemli hücre içi sinyal molekülleri olarak, son zamanlarda engel olarak ve hücre zarının bu işlev, hücresel süreçlerin compartmentalization içinde yapı taşları ve. Ancak, proteinlerin aksine, lipidler, küçük hidrofobik moleküllerdir öncelikle membran iletişim siteleri (MCSS) meydana varsayımla kötü açıklanan nonvesicular yolları, trafik. MCSS endoplazmik retikulum (ER) bir ortaklık organel, örneğin, plazma zarı (PM) ile doğrudan fiziksel temas yapan bölgelerdir. Bu lipid sentezini bu sitelere ve MCSS lipid trafiği için önemli olduğunu ima, lipid sentezleme enzimleri, ER-PM MCSS ER bölümü zenginleştirilmiştir. Maya 1000'den fazla hücre başına kişiler ve tüm ökaryotlarda korunmuş doğa, bolluk nedeniyle ER-PM MCSS çalışma için ideal bir model. MCSS oluşturan proteinler ortaya çıkararak hücrelerindeki lipidler trafik nasıl yapılır anlamak için önemlidir, ve sinyal molekülleri olarak hareket. Biz Scs2p denilen bir ER ER-PM MCSS lokalize bulundu ve kendi oluşumu için önemlidir. Biz Scs2p moleküler ortaklarının ortaya çıkarılması üzerinde duruldu. Protein kompleksleri tanımlanması geleneksel olarak ilk kez kütle spektrometresi tarafından peptidlerin protein bantları ve analiz jel sindirim jel elektroforez, saflaştırılmış protein örnekleri çözme dayanır. Bu genellikle proteinlerin küçük bir alt çalışma sınırlar. Ayrıca, protein kompleksleri işlem sırasında denatüre veya fizyolojik olmayan koşullara maruz kalmaktadır. Bu sorunları aşmak için, tarafsız ve nicel veri ayıklamak için büyük ölçekli nicel proteomik tekniği uyguladık. Biz, bir etiketsiz kontrol suşu proteinlerin zımba izotop çekirdekleri dahil hücre kültürü amino asitleri (SILAC) ile stabil izotop etiketleme kullanın. Eşit hacimli, etiketli, kültür ve etiketsiz, SILAC etiketli kültürü birbirine karıştırılır ve sıvı nitrojen içinde taşlama tarafından parçalanmış. Daha sonra protein kompleksleri aşağı çekmek için bir yakınlık arıtma işlemi yürütmek. Sonuç olarak, yüksek performanslı sıvı kromatografisi / tandem kütle spektrometresi ile analiz için hazır protein örnek, hızlandırabilir. En önemlisi, kontrol suşu proteinler ağır izotop etiketli ve etiketsiz proteinlere karşı yem zorlanma sayılabilir edilebilir bir kütle / yük değişimi üretecek. Bu nedenle, kirleticiler, ya da belirsiz bağlama kolayca ortadan kaldırılabilir. Bu yaklaşımı kullanarak, ER-PM MCSS lokalize birkaç roman proteinleri tespit ettik. Burada bizim yaklaşımımız ayrıntılı bir açıklama mevcut.

Protocol

Gereç ve Yöntem Maya suşları Bu çalışmada kullanılan tüm suşlar BY4742 arka plan üzerine dayanır. Arg4 silme suşu (G418: Mat, his3, ura3, leu2 ve Arg4): BY4742 (Mat alfa, çiftleşme SILAC kontrol suşu (Mat, his3, leu2, ura3, lys2 ve Arg4: G418) tarafından yapıldı his3, leu2, ura3 ve lys2) ve mayotik haploids tetrad diseksiyonu ile elde edilmiştir. Bu nedenle, kontrol suşu, lisin ve arjinin bir auxotroph. Yem gerilme vektörü pBS1479 ku…

Discussion

Arıtma işlemi sırasında kaydedilen alikotları (1) ön-temizlenir hücre lizat, (2) bağlı fraksiyon, (3) bağlanmamış fraksiyonu, ve (4) yıkandı, fraksiyon içermelidir. Biz Batı tarafından yukarıda alikotları protein içeriğini analiz deney bağlayıcı ve salınımlı etkinliğini yansıtmak için anti-TAP antikor veya gümüş boyama kullanarak blot önerilir. Gümüş lekeli bir jel ve leke örnekleri Şekil 1'de gösterilmiştir.

SILAC protein bağlayıcı ortakları,…