L'identificazione di complessi proteici con la proteomica quantitativa in S. cerevisiae

Summary

Qui si descrive una nuova tecnica di proteomica quantitativa per identificare i complessi proteici in Saccharomyces cerevisiae. In questo studio, abbiamo utilizzato il metodo SILAC insieme purificazione di affinità seguita dalla spettrometria di massa tandem per identificare con elevata specificità dei partner legame di una proteina ER, Scs2p.

Abstract

I lipidi sono i componenti delle membrane cellulari che funzionano come barriere e nella compartimentazione dei processi cellulari, e di recente, come importanti molecole di segnalazione intracellulare. Tuttavia, a differenza delle proteine, i lipidi sono piccole molecole idrofobiche che il traffico principalmente da poco descritto percorsi nonvesicular, che si ipotizza che si verifichino presso i siti di contatto a membrana (MCS). MCS sono regioni in cui il reticolo endoplasmatico (ER) rende il contatto fisico diretto con una partnership organello, ad esempio, membrana plasmatica (PM). La porzione di ER ER-PM MCS è arricchita in lipidi sintetizzare gli enzimi, il che suggerisce che la sintesi dei lipidi si rivolge a questi siti e implicando che MCS sono importanti per il traffico dei lipidi. Il lievito è un modello ideale per studiare ER-PM MCS a causa della loro abbondanza, con oltre 1000 contatti per cella, e la loro natura conservata in tutti gli eucarioti. Scoprire le proteine ​​che costituiscono MCS è fondamentale per capire come si realizza il traffico lipidi nelle cellule, e come si comportano come molecole di segnalazione. Abbiamo trovato che un pronto soccorso chiamato Scs2p localizzare a ER-PM MCS ed è importante per la loro formazione. Il nostro obiettivo è scoprire i partner molecolari di Scs2p. L'identificazione di complessi proteici si basa tradizionalmente sulla prima risolvere campioni di proteine ​​purificate mediante elettroforesi su gel, seguita da in-gel digestione delle bande proteiche e analisi dei peptidi mediante spettrometria di massa. Questo limita spesso lo studio di un piccolo sottoinsieme di proteine. Inoltre, complessi proteici sono esposti a denaturazione o non le condizioni fisiologiche durante la procedura. Per aggirare questi problemi, abbiamo realizzato un grande tecnica proteomica quantitativa per estrarre i dati imparziale e quantificati. Noi usiamo l'etichettatura degli isotopi stabili di aminoacidi nelle cellule in coltura (SILAC) per incorporare i nuclei di base di isotopi di proteine ​​in un ceppo di controllo senza tag. Volumi uguali di cultura tag e senza tag, la cultura SILAC marcati sono mescolati insieme e lisate dalla macinazione in azoto liquido. Abbiamo poi effettuare una procedura di purificazione di affinità di abbattere complessi proteici. Infine, precipitare il campione, che è pronto per l'analisi ad alte prestazioni cromatografia liquida / spettrometria di massa tandem. Ma soprattutto, proteine ​​del ceppo di controllo sono etichettati dai isotopo pesante e produrranno una massa / carica spostamento che può essere quantificata contro le proteine ​​senza etichetta nel ceppo esca. Pertanto, contaminanti, o legame aspecifici possono essere facilmente eliminati. Utilizzando questo approccio, abbiamo individuato diverse nuove proteine ​​che localizzano a ER-PM MCS. Presentiamo qui una descrizione dettagliata del nostro approccio.

Protocol

Materiali e Metodi Ceppi di lievito Tutti i ceppi utilizzati in questo studio si basano sullo sfondo BY4742. Ceppo di controllo SILAC (Mat uno, his3, leu2, ura3, lys2 e Arg4:: G418) è stata fatta con l'accoppiamento Arg4 ceppo cancellazione (Mat uno, his3, ura3, leu2 e Arg4:: G418) per BY4742 (Mat alfa, his3, leu2, ura3 e lys2), e la haploids meiotico sono stati ottenuti mediante dissezione tetrade. Pertanto, il ceppo di controllo è un auxotroph di lisina e a…

Discussion

Le aliquote salvati durante la procedura di purificazione dovrebbe includere (1) pre-cancellati lisato cellulare, (2) frazione legata, (3) frazione libera, e (4) frazione eluita. Si consiglia di analizzare il contenuto proteico del aliquote sopra mediante Western blotting utilizzando anticorpi anti-TAP o colorazione argento per riflettere l'efficienza di legame e eluizione di questo esperimento. Esempi di un gel colorato d'argento e una macchia sono mostrati in figura 1.

Dal SILAC ci…