Summary
Nous décrivons un processus utilisant le laser capture microdissection d'isoler et d'extraire l'ARN à partir d'une population cellulaire homogène, les neurones pyramidaux, dans la couche III du gyrus temporal supérieur dans les cerveaux post-mortem humain. Nous avons ensuite linéairement amplifier (T7-based) ARNm, et s'hybrident l'échantillon à la puce Affymetrix humaines X3P.
Abstract
Nous avons proposé d'étudier la réduction de matière grise dans le gyrus temporal supérieur chez les patients schizophrènes, en interrogeant les profils d'expression génique des neurones pyramidaux dans la couche III. Il est bien connu que le cortex cérébral est une structure extrêmement hétérogène comprenant diverses régions, des couches et des types de cellules, dont chacune est caractérisée par des compositions distinctes cellulaire et moléculaire et donc différentielle des profils d'expression génique. Afin de contourner les effets confondants de l'hétérogénéité des tissus, nous avons utilisé la capture microdissection laser (LCM) afin d'isoler notre spécifiques de type cellulaire des neurones pyramidaux savoir.
Environ 500 neurones pyramidaux colorés avec la solution de coloration ont été capturés à l'aide Histogene l'Arcturus LCM XT système. L'ARN a ensuite été isolé à partir des cellules capturées et subi deux séries de T7 à base d'amplification linéaire à l'aide d'Arcturus / Molecular Devices trousses. Le LabChip Experion (Bio-Rad) de gel et de bonne qualité électrophérogramme indique un ARN (m), avec une longueur de transcription étendre 600nt dernières requis pour biopuces. La quantité d'ARNm obtenu en moyenne 51μg, avec la pureté des échantillons acceptables dire, comme indiqué par le ratio A260/280, de 2,5. L'expression des gènes a été profilé à l'aide du tableau de l'homme X3P sonde GeneChip d'Affymetrix.
Protocol
Sectionnement des tissus 1):
Nous avons obtenu les tissus nécessaires (contrôle n = 9, la schizophrénie n = 9) de la Harvard Brain Center Resource tissus, appariés pour l'intervalle d'âge, le sexe et post-mortem (PMI) (tableau 1). Azote liquide blocs de vapeur ont été d'environ 3 mm d'épaisseur ont été prises de la zone 42 de Brodmann (gyrus temporal supérieur).
Avant de commencer la coloration des neurones pyramidaux, les conditions doivent être optimisés afin d'obtenir optimale des tissus "ascenseur" et de haute qualité de l'ARN. Tissu «ascenseur» décrit le processus au cours laser capture microdissection, où les neurones marqués pour la capture adhérer à la casquette et sont séparés alors que le tissu restant est laissé derrière.
Optimisation:
- Afin de réduire l'activité RNase, ce qui compromet la qualité de l'ARN, traiter toutes les surfaces, y compris la zone de travail, le sectionnement lame et lames avec une solution de décontamination RNase, tels que la RNase Zap, en plus d'essuyer avec de l'éthanol à 100%.
- Section des tissus avec le cryostat fixé à -17 ° C. Cela réduit le gradient de température entre la température ambiante (slides), le cryostat, et la glace sèche (voir processus complet ci-dessous). Si la température est en dessous de -20 ° C, les coupes de tissus ont tendance à déchiqueter, les rendant inutilisables. Supérieur, et le gradient de température augmente, ce qui peut compromettre l'intégrité de l'ARN.
- Les sections doivent être 8μm épaisse, comme des sections plus épaisses seront finalement compromettre le tissu "ascenseur". Cette épaisseur permet également l'identification correcte des neurones pyramidaux pour la capture.
- Utilisez plaine des lames de verre non chargées (par exemple Histogene diapositives LCM) en tant que celles-ci ne pas interférer avec le tissu «ascenseur» durant le processus de capture laser. Membrane diapositives peuvent également être utilisés, mais ils sont plus adaptés à isoler les structures importantes de tissus, comme la membrane tend à soulever légèrement au cours du processus de capture au laser, ce qui augmente l'infrarouge (IR) la taille du spot laser et diminue la spécificité cellulaire.
- Monter deux sections par lame de verre, comme plus de deux sections par diapositive pourrait compromettre la qualité de l'ARN en raison de la variation constante de la température pendant le processus de coupe.
- Après sectionnement, placer les diapositives immédiatement dans une boîte à lames micro sur glace sèche afin de préserver l'intégrité ARN. Boîtes de diapositives contenant les sections du cerveau sont ensuite stockés à -80 ° C jusqu'à leur transformation.
Nous avons déjà déterminé que pour les neurones pyramidaux, 500 cellules par cas sont adéquates afin d'acquérir suffisamment d'ARN à l'hybridation de biopuces. Environ quatre sections sont nécessaires par cas, principalement en raison de la coupe et la coloration des artefacts.
2) Coloration des neurones pyramidaux:
Identification des neurones pyramidaux est réalisé avec la solution de coloration Histogene rapide et kit, car il nous permet de visualiser ces neurones, sans exposition prolongée à des solutions aqueuses, préservant ainsi l'ARN.
- Préparez-vous à la procédure de coloration en ajoutant 1 microlitre inhibiteur de RNase par 100 pi de solution de coloration (par exemple Promega) afin de limiter l'activité RNase. Quatre sections (2 toboggans), nécessitent 4μl d'inhibiteur de RNase ajoutés à 400μl de la solution de coloration Histogene dans un microtube de 1.5ml (conservés sur la glace). Pour chaque section, nous utilisons 97μl de cette solution, qui nous donne une coloration suffisante pour identifier les neurones pyramidaux.
- Préparer des séries de déshydratation et xylène: 25ml aliquote de la éthanols appropriée dans les pots coloration fourni avec le kit Histogene, c'est à dire 2x75%, 95%, 100% et 2 pots de l'eau sans RNase. Placez tous les bocaux dans un seau à glace, sauf pour un pot de 75%, ce qui vous placez dans le congélateur à -20 ° C. Sous une hotte, ajouter les tamis moléculaires dans le bocal Xylène pour enlever l'excès d'eau, ce qui pourrait compromettre les tissus "ascenseur".
- Allumer le bain-marie (ou bloc thermique) avec la température réglée à 42 ° C et placer un tube 50ml Falcon soutenu par une grille dans le bain-marie.
- Retirez les deux diapositives de -80 ° C et le dégivrage eux sur une Kimwipe pendant environ 30 secondes, ou jusqu'à ce que les coins de la glisse commence à dégeler.
- Brièvement fixer les lames dans l'éthanol à 75% pendant 30 secondes dans le congélateur à -20 ° C. Transférer la glisse entre cuvettes à l'aide de RNase zappé pince pour réduire la contamination.
- Après un lavage de 30 secondes eau sans nucléase, les sections peuvent être décrites avec un stylo barrière de PAP, afin de concentrer la solution de la section, mais avec la lame de verre clair, cela n'est pas absolument nécessaire.
- Colorer les quatre sections avec la solution de coloration Histogene pendant 20 secondes, avec 97μl de l'inhibiteur de taches / RNase par section. Par la suite, déshydrater les sections dans les éthanols préalablement préparé sur la glace, pendant 30 secondes par étape. L'étape finale d'éthanol à 100% devrait être étendue à 3 minutes, Afin de parvenir à une déshydratation suffisante pour tissus "ascenseur" adéquate et de capture sur les chapeaux de LCM.
- Immerger les lames dans du xylène pendant 5 minutes et sécher à l'air dans une hotte pour un autre 5 minutes avant la capture.
Les étapes de coloration doit être effectuée que si la capture laser immédiatement après. Toutes les solutions doivent être changés tous les 4-6 diapositives afin de prévenir la contamination et pour garantir la déshydratation appropriée.
3) une cellule unique laser capture microdissection:
Après coloration, les neurones pyramidaux de la couche III sont supprimés en utilisant le laser capture microdissection, avec le système Arcturus XT et le logiciel. En bref, le système fonctionne par impulsions une force réglable laser IR à travers un film thermoplastique situé à la base d'un plafond, ce qui entraîne l'extension / la distension du film directement sur les cellules d'intérêt. Quand le bouchon est levé à partir des tissus, les cellules restent capturé / captifs sur le bouchon. Un résumé picturale est donnée dans la figure 1.
Avant de commencer cette procédure, il est important de distinguer entre les deux types de capsules disponibles avec ce système. Alors que le bouchon CapSure Macro est généralement utilisé pour capturer de plus grandes structures des tissus, les bouchons CapSure SH sont conçus pour capturer de petits nombres de cellules individuelles et par conséquent, ces bouchons ont une plus petite surface de captage désignés. Les bouchons SH ont aussi des rails qui empêchent le bouchon d'être en contact direct avec la section des tissus, tandis que le bouchon de macro ne fonctionne pas. Ces rails de réduire l'effet de pliage des tissus qui peuvent affecter ou d'induire une variabilité de la taille du spot (de l'impulsion laser) que le bouchon se trouve directement sur Macro plié, tissus inégale. Pour notre procédure, nous avons utilisé les bouchons SH pour profiter de leur capacité à réduire l'effet de pliage des tissus, mais a gardé les paramètres macro bouchon sur le logiciel afin de maximiser la zone capturée que nous sommes la capture d'un grand nombre de cellules.
- Charger les lames et les bouchons sur l'appareil Arcturus XT. Utiliser les capuchons CapSure HS, mais garder le réglage du programme sur la macro. Cliquez sur la case "Charger avec aperçu" pour obtenir une photo vue d'ensemble de chaque diapositive.
- Réglez la luminosité / focus à un grossissement de 2x, afin de déterminer quelle section serait optimal pour la capture laser. Éviter les coupes de tissus avec le pliage excessif, mais plutôt choisir les sections qui sont intacts, lisse et coloré bien, surtout près de la région d'intérêt soit de couche III.
- Nous avons ensuite placer un bouchon sur la zone générale où nous serons capture, en veillant à inclure la couche III. Toujours au grossissement 2x, assurez-vous que les rails de toit ne repose sur aucun plis, car cela fera pencher la casquette.
- Ensuite, nous confirmer l'emplacement de la tache laser IR manuellement à l'agrandissement 40x. Si la tache (faisceau rouge) n'est pas en corrélation avec la croix bleue, ce qui peut être ajustée en cliquant-droit sur le champ et en sélectionnant "spot situé IR".
- A 40x, on peut commencer à identifier les neurones pyramidaux selon les critères suivants (1) les cellules qui sont une forme pyramidale et (2) de la partie proximale des dendrites apicales et / ou basales sont identifiables (Fig. 1A).
Nous avons maintenant ajuster la puissance et la durée de l'impulsion laser dans le but de capturer le neurone pyramidal. Ceci est particulièrement important, car il détermine la spécificité de la cellule capturée en plus le nombre de cellules capturées. Si l'impulsion est trop faible ne sont pas tous les neurones identifiés seront capturés, tandis que si l'impulsion est trop fort, il pourrait capturer les cellules des tissus environnants / autres que le neurone seul. Généralement, avec les spécifications de tissus et cellules utilisés ici, la force laser (70mW) et la durée (16msec) se traduisent par une taille de spot de 25 um, environ en ligne avec la taille des neurones pyramidaux (Fig. 1B). Toutefois, ces paramètres sont affinés pour chaque section afin d'obtenir à peu près la taille au même endroit par cas. Si «ascenseur» est compromise, on peut toujours augmenter le nombre de cellules capturées afin de maintenir la quantité d'ARN obtenu à partir de chaque cas comparables. Toutefois, veillez à garder votre temps de capture, y compris coloration moins de 1,5 heures, plus longtemps que cela peut compromettre la qualité de l'ARN.
- D'abord enregistrer la position de la PAC en cliquant sur le signe plus à la fonction de position. De cette façon, si pour une raison quelconque, nous devons enlever le bouchon et ensuite besoin de le remettre au même endroit, le plafond sera toujours revenir précisément à l'endroit même où vous avez ajusté la taille du spot pour.
- Entrez ces valeurs dans la boîte de commande: 70 en puissance et en durée 16. Décochez la "passer stade auto" option, et assurez-vous que le symbole de la bonne taille est corrélée avec le symbole sur le panneau de droite.
- Sélectionnez l'option cercle (en bas à droite) pour sélectionner un neurone que vous souhaitez tester la capture, puis d'activer le laser en cliquantle «test IR spot».
- Le spot fait par le laser convient tout d'abord avoir un anneau nettes sombres autour de l'objet capturé. Si cet anneau est trop léger, la cellule n'a pas été capturé. S'il ya une tache sombre au milieu de l'anneau sombre, puis la force laser / durée est trop grand, et il pourrait avoir un effet négatif sur l'ARN présent dans la cellule capturés. Assurez-vous que l'anneau est assez grand pour englober la cellule, mais assez petit pour qu'il ne comprend pas les tissus indésirables ou d'autres cellules.
- Répétez le processus sur différentes parties du tissu dans la couche que vous souhaitez capturer, afin de vérifier que la taille du spot ne diffère pas selon l'endroit. Ajuster en conséquence.
- Une fois le spot laser a été ajusté, de continuer à identifier les neurones pyramidaux pour la capture. Nous identifions d'environ 500 cellules par échantillon, ce qui se traduit par environ 500pg d'ARN total par échantillon. Nous avons aussi généralement que l'utilisation d'une section afin de réduire la quantité de temps de capture, comme la PAC doit être réajusté pour chaque section. Lorsque vous avez identifié toutes les cellules dont vous avez besoin, appuyez sur le bouton laser de capture et de toutes vos cellules seront automatiquement saisies sur le bouchon (Fig. 1C).
- Une fois que toutes les cellules ont été capturés, déplacez le bouchon d'une partie différente de la diapositive qui ne contient pas une section. Retournez à l'endroit où les cellules ont été capturés et s'assurer qu'au moins 90% des neurones ont été enlevés. Si non, n'essayez pas de retrouver les mêmes cellules, mais de localiser la zone où la plupart des cellules ont été capturés, et de capturer plus de cellules dans la même zone. Déplacer le bouchon à la station de Québec.
- Placez le bouchon dans le tube à centrifuger de 0,5 ml d'Applied Biosystems (cat. # N8010611) contenant 50 ml de tampon d'extraction (PicoPure RNA kit). Le plafond a été conçu pour s'intégrer parfaitement dans ce tube spécifiques pour prévenir les fuites mémoire tampon.
- Tourner l'ensemble à l'envers, en s'assurant que tampon d'extraction couvre toute la calotte et le placer au fond du tube 50ml Falcon déjà présent dans l'ensemble bain-marie à 42 ° C. Les neurones sont incubées pendant 30 minutes afin d'enlever le tissu de la PAC.
- Par la suite, le tube de centrifugation et de montage plafond pour 2 minutes à 800 g. Retirez le bouchon et conserver l'extrait cellulaire restant à -80 ° C jusqu'à l'extraction d'ARN. Comme précaution supplémentaire, vous pouvez ré-examiner le bouchon à la station de Québec sur l'appareil capture laser afin de s'assurer que tous les neurones ont été retirés de la PAC elle-même.
4) Obtenir l'ARN à partir des populations neuronales spécifiques:
On peut aller directement à partir de la capture à l'isolement, ou le dégel de l'échantillon stocké dans le congélateur à -80 ° C. Dans notre expérience, nous avons d'abord rassemblé tous les échantillons nécessaires et les a stockées à -80 ° C avant de procéder à l'ARN isolement.
Isolement d'ARN est réalisée en utilisant le kit d'isolation PicoPure, qui est conçu pour isoler un petit nombre de cellules à partir d'échantillons de LCM et de conserver à faible abondance de l'ARNm. En général, nous suivons le protocole qui est inclus avec le kit. Ci-dessous, nous donnons une description de base du processus.
- Après décongélation, ajouter 70% d'éthanol (fourni avec le kit) et centrifuger sur une colonne de purification pré-conditionné de manière à lier l'ARN pour le filtre de la colonne.
- Après le lavage, le traitement de l'ARN à la DNase afin d'assurer une élimination complète de l'ADN afin d'éliminer le risque d'interférence ADN. Cette étape est particulièrement importante dans les applications en aval telles que temps réel qRT-PCR.
- Après la digestion de l'ADN, il ya une autre étape de lavage. Vérifiez qu'il n'ya pas de tampon de lavage reste dans la colonne avant de les transférer à un autre microtube, comme toute présence de la mémoire tampon dans votre échantillon final se traduira par moins de départ pour l'amplification d'ARN. Pour ce faire, nous avons l'étape de centrifugation lavage final pendant 2,5 minutes au lieu de 2 minutes comme le suggère le protocole fourni.
- Enfin, tampon d'élution est ajouté et incubé sur le filtre dans la colonne pendant 1 minute suivie d'une centrifugation, afin d'éluer l'ARN total.
- Pipeter 1.3ul de chacun des échantillons dans des tubes séparés 0.5ml d'exécuter une Experion HighSens LabChip. Congelez le reste de l'échantillon à -80 ° C.
Le contrôle qualité est très important lorsqu'on isole l'ARN, en particulier quand la quantité est faible et la quantité nécessaire, comme pour les expériences de puces à ADN (15μg), est grande. L'ARN extrait doit donc subir un contrôle de qualité à divers moments tout au long du processus. La première se produit après l'extraction. Nous établissons l'intégrité des ARN totaux par l'intermédiaire examen macroscopique des pics 18S/28S de l'électrophérogrammes et gel virtuelle générée par Experion HighSens LabChip. Cette méthode est rapide et fournit deux moyens de mesure pour vérifier la qualité de l'ARN-un électrophérogramme et un gel virtuel (Fig. 2). Si la qualité de l'ARN total est relativement bonne (Fig.. 2A, B vs C, D), nous avons ensuite procéder à linéairement amplifiant l'ARNm, qui représente environ 2% de l'ARN total.
5) l'amplification linéaire:
Amplification de l'ARN extrait du laser capturé tissus est nécessaire afin de produire une quantité suffisante de l'ARN pour hybridation puces ultérieures et QRT-PCR expériences. Afin de minimiser la possibilité d'confond potentiels noté avec T7 à base d'amplification linéaire, nous avons minimisé le nombre de cycles d'amplification nécessaires en maximisant le montant de la commencer par laser des matériaux capturés tissus.
Nos données préliminaires (non montré) suggèrent que les deux tours de l'amplification linéaire (RiboAmp HS PLUS kit) de l'ARN total extrait des tissus qui contiennent environ 500 cellules produirait environ 50μg d'Arna - suffisante pour l'exécution de deux puces et QRT-PCR expériences. Si possible, éviter de transférer inutile de l'échantillon entre 0,2 ml et 0,5 ml tubes en utilisant des blocs de 0.5ml dans le thermocycleur et les tubes de 0.5ml fourni dans le kit.
Encore une fois, le protocole suivi est celui fourni avec le kit. Une version abrégée est décrite ici.
- Ajouter 1 microlitre de l'amorce fournie à l'échantillon d'ARN totaux (environ 11μl) et incuber à 65 ° C pendant 5 minutes, suivi par le froid à 4 ° C pendant 1 minute.
- Ajouter des composants premier brin d'ADNc avec la transcriptase inverse SuperScript III et incuber à 42 ° C pendant 1 heure.
- Après synthèse du second brin d'ADNc, de purifier l'ADNc résultant à travers une colonne de purification fourni. Ici, nous recommandons que lors du transfert de l'échantillon, plus le tampon de liaison à la colonne de purification, pour centrifuger les tubes d'échantillon à deux reprises - une fois après le transfert de l'échantillon à la colonne, comme à 1 microlitre de l'échantillon reste sur les côtés des tubes après le transfert.
- Laver les ADNc avec le tampon de lavage fourni et éluer l'ADNc purifiés avec le tampon d'élution.
- Ajoutez les composants de transcription in vitro et incuber pendant 6 heures à 42 ° C.
- Après une étape de DNase, de purifier l'ARNa résultant avec les tampons fournis, finalement élution sur un total de 12μl de tampon d'élution.
L'ARN subit un nouveau cycle d'amplification linéaire (avec des amorces distinctes - voir kit protocole), après quoi plusieurs étapes de contrôle qualité sont employés. Un ul de l'échantillon est dilué à environ 250ng/ul pour déterminer la longueur transcription d'ARNm et de la concentration avec le LabChip StdSens (Experion). Traditionnelle Affymetrix la technologie des puces nécessite l'ARNm d'être au moins 600 nucléotides de long pour pouvoir être détectée. Le gel et électrophérogramme obtenu à partir de l'LabChip devrait donc représenter cette longueur minimale ARNm transcrit (Fig. 3).
Un contrôle de qualité supplémentaire est déterminée par une analyse spectrophotomètre NanoDrop, où un ratio constitué de deux densités optiques, c'est à dire A260 et A280, qui détermine la pureté ARN. Les échantillons ayant une densité optique d'environ 2,1 devraient être étiquetés pour l'analyse de l'expression des gènes, même si les ratios jusqu'à 2,7 ont été montré pour avoir la qualité de l'hybridation comparables. La concentration doit également être compris entre 800ng/μl-1μg/μl, comme plus faible que ce qui a conduit à la dégradation de l'ARN pendant le stockage (même à des températures inférieures à -80 ° C) et a également conduit à des résultats biopuces pauvres.
6) échantillons d'ARNm Biotine-étiquetage pour les puces à ADN Affymetrix analyse:
Le kit de marquage TURBO biotine (fin-étiquetage) de Molecular Devices est utilisé pour étiqueter les ARNa obtenu à partir d'échantillons amplifiés. Une version abrégée de ce protocole est donné ici.
- Réglez le volume de 20 ug de chaque échantillon ARNa au total 13μl en ajoutant une eau sans nucléase ou en concentrant l'échantillon dans une centrifugeuse sous vide, en fonction de la concentration initiale. Même si seulement 15μg est nécessaire pour la puce Affymetrix utilisées, nous ajoutons 20 pg à la réaction initiale, comme certains ARN est perdu pendant l'incubation et de centrifugation.
- Incuber la réaction biotine à 85 ° C pendant 30 minutes, puis réfrigérer à 4 ° C.
- Retirez l'étiquette biotine excès par centrifugation avec la colonne spécialisés fournis avec le kit. Dans certains cas, surtout avec l'ARNm dégradés tels que celui obtenu par la FFPE (fixé au formol et inclus en paraffine) des échantillons, il pourrait être le cas que tous les ARNm est élue dans l'étape de centrifugation simple. Nous avons alors recommandé d'ajouter entre 1-5uL supplémentaires eau sans nucléase de la colonne avec une étape de centrifugation supplémentaire subséquente de 1 minute. Cela garantit que la plupart de l'échantillon marqué est élue.
- Le volume final est 20 pi, avec une concentration de 1μg/μl. Si supplémentaires eau sans nucléase a été ajouté, de concentrer les échantillons à lavolume correct avec une centrifugeuse sous vide. Nous recommandons de conserver la concentration de stockage avant de commencer une hybridation plus 800ng/μl, car nous avons constaté que moins de ce qui conduira à une dégradation pendant le stockage et / ou d'hybridation qui donne des résultats biopuces pauvres.
ARNa a ensuite été hybridée et l'expression des gènes profilé, en utilisant le tableau de l'homme X3P sonde GeneChip d'Affymetrix. Comme cette puce a été conçue pour ARNa dégradé plus, nous l'avons utilisé comme une mesure de précaution, autant de facteurs que nous ne pouvons pas contrôler peuvent affecter la qualité des tissus post-mortem. Comme notre laboratoire n'avait pas les installations adéquates pour l'hybridation, le processus a été effectuée à l'installation de partenaires principaux génomique.
Les résultats représentatifs:
1 tissu +2 +3) sectionnement, la coloration des neurones pyramidaux et laser capture microdissection:
Le protocole décrit ci-dessus devraient donner lieu à deux lames avec quatre sections par diapositive. Chaque section doit être lisse avec un minimum de déchirer, de fissuration et le pliage. Avec coloration correcte, la tache sera d'identifier sombre teinté neurones pyramidaux autour de 20 - 25 um en taille avec une forme pyramidale et visible dendrites apicales. Avec les bouchons HS CapSure à des réglages macro, et le réglage correct de la puissance du laser et la force pour chaque section, vous devriez obtenir environ 500 à 700 cellules par section / cas faisant au moins 500pg d'ARN total. Environ 85 - 100% des neurones se conformera à la PAC (Fig. 1).
4) Obtenir l'ARN à partir des populations neuronales spécifiques:
Tel que décrit, après isolement de l'ARN total, nous vérifions la qualité de l'ARN à l'aide d'un électrophérogramme et gel virtuel via l'Experion Bio-Rad. Dans le électrophérogramme, vous devriez voir deux pics distincts correspondant à la 18S et 28S du ribosome unités ARN. Avec des tissus post-mortem, cependant, ce n'est pas toujours le cas, que le tissu peut être dégradé en raison de facteurs avant de sectionnement. Vous verrez normalement une dégradation grosse bosse indiquant, avec un pic large autour de 18S, 28S et un petit pic (Fig. 2A, B). Tant que les profils sont comparables dans électrophérogramme échantillons, nous avons trouvé cette ligne directrice d'aboutir à la qualité de l'ARNm assez bon pour réaliser deux études de RT-PCR et puces (Imbeaud et al., 2005).
Si il ya une dégradation trop - comme indiqué par une grande surface sous la courbe de l'électrophorégramme, ou si les pics ne sont pas visibles (Fig. 2C, D) - les cellules doivent être saisies à nouveau par le tissu. Nous recommandons aussi de faire un test tissulaire gratter, où l'ARN est extrait à partir de fragments ensemble de la section (et pas seulement les cellules), avant de reprendre les cellules pour déterminer si le bloc de tissu lui-même est dégradé.
5) l'amplification linéaire:
Pour tester la qualité de l'ARNm après deux tours de l'amplification linéaire, nous avons utilisé à la fois du Bio-Rad LabChip Experion StdSens et le spectrophotomètre NanoDrop. Traditionnelle Affymetrix la technologie des puces nécessite l'ARNm d'être au moins 600 nucléotides de long pour être détectée, ce qui a été obtenu avec ce protocole. En fait, les longueurs d'ARNm ont été détectés dans la gamme de 1000 nucléotides. L'électrophorégramme reflète également cette grande avec des pics descend lentement en fonction du temps (Fig. 3A, B).
Les lectures NanoDrop indiqué une moyenne A260/A280 rapport de 2,5 entre les échantillons, indiquant ARNm viables (tableau 2).
Nos résultats indiquent que, avec ce protocole, la quantité et la qualité de l'ARN obtenu est assez bon pour interroger les différences d'expression génique via les GeneChip d'Affymetrix humaines X3P.
6) échantillons d'ARNm Biotine-étiquetage pour les puces à ADN Affymetrix analyse:
Après l'hybridation à l'GeneChip d'Affymetrix humaines X3P, nous avons obtenu des appels pour cent d'une moyenne de 26,6% (tableau 2), indiquant l'hybridation adéquates et des intensités de la sonde.
Tableau 1: Résumé de la cohorte
| Échantillons | Groupe | Sex | Âge | PMI |
| C1 | CONTRÔLE | F | 79 | 15,00 |
| C2 | CONTRÔLE | M | 22 | 21,47 |
| C4 | CONTRÔLE | M | 75 | 20,25 |
| C5 | CONTRÔLE | M | 80 | 15,50 |
| C6 | CONTRÔLE | F | 58 | 21,08 |
| C8 | CONTRÔLE | M | 61 | 17,00 |
| C10 | CONTRÔLE | F | 71 | 20,50 |
| C11 | CONTRÔLE | F | 12,66 | |
| C12 | CONTRÔLE | F | 86 | 6,92 |
| MOYENNE | 4M/5F | 69,11 | 16,71 | |
| S1 | SCHIZOPH. | F | 93 | 6,92 |
| S2 | SCHIZOPH. | M | 55 | 21,40 |
| S3 | SCHIZOPH. | F | 67 | 21,80 |
| S4 | SCHIZOPH. | F | 55 | 22,00 |
| S5 | SCHIZOPH. | M | 36 | 17,97 |
| S6 | SCHIZOPH. | M | 62 | 10,75 |
| S8 | SCHIZOPH. | F | 92 | 17,80 |
| S11 | SCHIZOPH. | M | 56 | 21,83 |
| S12 | SCHIZOPH. | F | 88 | 13,33 |
| MOYENNE | 4M/5F | 68,11 | 16,90 |
Abréviations: F - femmes, M - Homme, PMI - l'intervalle post-mortem, schizoph. - La schizophrénie.
Tableau 2: Résumé des résultats illustrant la concentration d'ARN, la qualité et efficacité de l'hybridation
| Échantillons | [ARNm] ng / ul | A260/A280 | Intensité de la sonde | Appelez pour cent |
| C1 | 1318.01 | 2,67 | 63 | 19,5 |
| C2 | 2312.93 | 2,37 | 147 | 30,6 |
| C4 | 1811.92 | 2,44 | 69 | 26,6 |
| C5 | 1316.26 | 2,51 | 78 | 34,7 |
| C6 | 1663.24 | 2,39 | 66 | 33,8 |
| C8 | 633,05 | 2,54 | 101 | 15,2 |
| C10 | 1326.4 | 2,47 | 92 | 32,5 |
| C11 | 994,24 | 2,75 | 76 | 22,4 |
| C12 | 817,23 | 2.7 | 56 | 15,2 |
| S1 | 2560.88 | 2,47 | 78 | 25,0 |
| S2 | 2169.61 | 2,43 | 76 | 26,5 |
| S3 | 2067.32 | 2,52 | 87 | 22,1 |
| S4 | 1563.89 | 2,75 | 82 | 28,1 |
| S5 | 2071.44 | 2,44 | 88 | 28,2 |
| S6 | 2532.59 | 2,34 | 72 | 30,7 |
| S8 | 2189.22 | 2.5 | 62 | 31,8 |
| S11 | 1669.89 | 2,47 | 41 | 27,3 |
| S12 | 1739.35 | 2,47 | 42 | 28,0 |
| MOYENNE | 1708.75 | 2,51 | 76,44 | 26,57 |
Figure 1:. Résumé du processus de microdissection laser capture A) des neurones pyramidaux sont identifiés morphologiquement. B) Après le laser pulsé a travers le film thermoplastique, les cellules adhèrent à la PAC et ne sont donc plus sur la lame, laissant derrière les tissus environnants. C) Microphotographie d'une population cellulaire homogène adhérant sur le Cap CapSure après laser capture.
Figure 2:. Contrôle de la qualité totale ARN A + B) Représente l'ARN de bonne qualité totale après l'isolement, tandis que C + D) illustre ce que l'ARN total ne doit pas ressembler après l'isolement. A) Un électrophérogramme avec des pics clairs 18/28S correspondante avec le gel virtuel (B). C) Un électrophérogramme montrant une grande surface sous la courbe et pas de pics 18S/28S indiquant dégradation de l'ARN. Ceci est également montré dans le gel virtuel (D).
Figure 3:. Contrôle de la qualité ARNm A + B) Electrophorégramme (A) et virtuels gel (B) indiquant la transcription d'ARNm Longe (spread) nécessaires pour les études de microréseaux, c'est à dire s'étendant au-delà 600 nucléotides (nt). C + D) Electrophorégramme (C) et un gel virtuel (D) montrant ce qu'est une diffusion insuffisante ARNm ressemblerait, comme la longueur transcription d'ARNm ne s'étend pas 200nt passé.
Discussion
Ici, nous essayons de personnaliser un protocole pour extraire les populations de cellules homogènes à partir de tissus post-mortem du cerveau hétérogènes utilisant le système d'Arcturus XT et des kits d'extraction d'ARN liées. Comme indiqué plus haut, nous avons apporté quelques modifications aux protocoles originaux fournis par l'entreprise, afin de maximiser l'intégrité ARN. La capture réussie de cellules individuelles dépend uniquement de l'optimisation des étapes avant la capture afin d'atteindre les cellules au maximum avec de l'ARN bon. Ces étapes comprennent les différents paramètres associés à des tissus de sectionnement et coloration. En bref, en ce qui concerne la préparation des tissus, notamment: 1) réduire le gradient de température lors de sectionnement, 2) que de placer deux sections par diapositive, 3) exécuter toutes les étapes de la déshydratation sur la glace, 4) en ajoutant l'inhibiteur de RNase à la tache, 5) l'augmentation la durée de déshydratation dans la finale d'éthanol à 100% à 3 minutes.
En ce qui concerne la capture, nous pensons que la combinaison de CapSure HS casquettes, avec le logiciel sur le réglage macro, devrait garantir des résultats optimaux. Un environnement à humidité contrôlée est critique pour la capture des cellules individuelles, que l'humidité élevée réduit considérablement les tissus "ascenseur". Des températures élevées peuvent aussi avoir un effet négatif sur la qualité de l'ARN.
Pendant le protocole d'isolement d'ARN avec le kit PicoPure, il ya deux étapes de lavage. Il est important de vérifier que tous les tampons de lavage est retirée avant le transfert à un autre tube à centrifuger pour l'élution d'ARN, comme toute présence de la mémoire tampon dans votre échantillon final se traduira par moins d'ARN de départ pour l'amplification. Pour ce faire, nous avons l'étape de centrifugation lavage final pendant 2,5 minutes au lieu de 2 minutes comme le suggère le protocole fourni.
Pour la plupart, le protocole d'amplification linéaire a été conformément aux instructions du fabricant. Toutefois, deux points cruciaux doivent être pris en compte lors de l'utilisation de ce protocole: 1) essayer de limiter la perte de l'ARN par l'intermédiaire de transférer l'excès d'échantillons entre les tubes, en utilisant uniquement des tubes 0.5ml fournis en conjonction avec un bloc de 0,5 ml dans le thermocycleur et 2) lors du transfert de l'échantillon à la colonne de purification pour la purification de l'ADNc, n'oubliez pas de spin-down des tubes d'échantillon après le premier transfert. Cela se traduira par un supplément de 1-2UL de l'échantillon à ajouter à la colonne de purification et ne peut donc augmenter la récupération d'ADNc.
Lors de l'utilisation du TURBO fin kit de marquage pour la biotine-étiquetage de vos échantillons ARNa limité, nous vous suggérons d'ajouter un supplément de quelques ul d'eau avant l'étape de centrifugation, d'augmenter le rendement de l'ARN étiquetés extraite de la colonne. Une minute supplémentaire de centrifugation seront également utiles à cet égard, surtout si vous travaillez avec des tissus dégradés, tels que les tissus FFPE.
Nous sommes convaincus que ce protocole permettra à l'utilisateur d'isoler de petites structures homogènes, comme les populations seule cellule, au sein de tissus post-mortem du cerveau hétérogène. Cela réduit les effets de dilution des structures environnantes et d'autres types de cellules situées dans les différentes couches dans le cerveau, conduisant à des résultats ciblés vers les types de cellules spécifiques de l'enquête. Comme la qualité de l'ARN résultant est assez bon pour les études de puces à ADN, nous pouvons commencer à identifier des signatures moléculaires spécifiques des populations de cellules spécifiques affectés dans les états pathologiques.
Disclosures
La production de cette vidéo article a été parrainé par Life Technologies.
Acknowledgments
Nous remercions Molecular Devices technologies analytiques / Arcturus pour leur généreux don de réactifs utilisés pour l'étude. Nous remercions également le Centre de Harvard ressources pour fournir des tissus post-mortem du tissu cérébral humain Financement:. RO1MH76060 et P50MH080272.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4.5” Forceps | VWR international | 82027-392 | |
| Arcturus XT™ Laser-Capture Microdissection (LCM) System | MDS Analytical Technologies | 13821-00 | |
| CapSure™ HS LCM Caps | MDS Analytical Technologies | LCM 0214 | |
| CapSure® Macro LCM Caps | MDS Analytical Technologies | LCM 0211 | |
| Experion™ Automated Electrophoresis Station | Bio-Rad | 700-7001 | |
| Experion™ RNA HighSens Chips | Bio-Rad | 700-7155 | 10 chips |
| Experion™ RNA HighSens Reagents | Bio-Rad | 700-7156 | 10 chips |
| Experion™ RNA StdSens Chips | Bio-Rad | 700-7153 | 10 chips |
| Experion™ RNA StdSens Reagents | Bio-Rad | 700-7154 | 10 chips |
| Falcon® polypropylene Conical tube | BD Biosciences | 352070 | |
| GeneAmp® thin-walled reaction tube with domed cap | Applied Biosystems | N8010611 | |
| GeneChip® Human X3P array | Affymetrix | 900516 | 6 chips |
| Histogene® LCM Frozen Section Staining kit | MDS Analytical Technologies | KIT0401 | For staining solution, jars, ethanols and Xylene |
| Histogene™ LCM slides | MDS Analytical Technologies | 12231-00 | |
| Micro Slide Box | VWR international | 48444-004 | |
| Microm HM 505E cryostat | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22-050-350 | Catalogue number for similar product as current product no longer available |
| Microprocessor Controlled 280 series Water bath | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 51221048 | Model 282 |
| Molecular Sieve | EMD Millipore | MX1583L-1 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Inc. | n/a | The NanoDrop 1000 is not available anymore, but the NanoDrop 2000 is comparable. |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9932 | |
| PEN Membrane glass slides | MDS Analytical Technologies | LCM 0522 | |
| PicoPure® RNA Isolation kit | MDS Analytical Technologies | KIT0204 | |
| RiboAmp®HSPLUS with Biotin labeling | MDS Analytical Technologies | KIT0511B | 12 reactions Includes TURBO biotin labeling™ kit |
| RNase Zap® | Ambion | AM9780/2 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| RNasin® Plus | Promega Corp. | N261B | |
| SuperScript™ III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080-044 |
References
- Imbeaud, S., Graudens, E., Boulanger, V., Barlet, X., Zaborski, P., Eveno, E., Mueleer, O., Schroeder, A., Auffray, C. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Res. 33, e56-e56 (2005).
