Трансфекция ДНК млекопитающих скелетных мышц использованием В Vivo Электропорация
Summary
Мы описываем подробные процедуры для эффективной трансфекции ДНК плазмиды в волокнах мышц стопы живых мышах электропорации и последующей визуализации экспрессии белка с помощью флуоресцентной микроскопии.
Abstract
Растущий интерес к клеточной биологии заключается в выражении transgenically изменение формы необходимых белков (например, флуоресцентной меткой конструкций и / или мутантных вариантов) с целью изучения их распределения эндогенных и функциональной значимости. Интересный подход, который был реализован для выполнения этой задачи в полностью дифференцированных клеток<em> В естественных условиях</em> Трансфекции плазмиды с помощью различных методов в специфические ткани, такие как печень<sup> 1</sup>, В скелетных мышцах<sup> 2,3</sup>, И даже мозг<sup> 4</sup>. Приведем здесь подробное описание шагов, которые необходимо соблюдать для того, чтобы эффективно трансфекции генетического материала в волокнах<em> Сгибателей пальцев Brevis</em> (FDB) и<em> Interosseus</em> (IO) мышц взрослых мышей использованием<em> В естественных условиях</em> Электропорации подход. Экспериментальные параметры были оптимизированы так, чтобы максимизировать количество мышечных волокон трансфекции при минимизации ткани убытки, которые могут ухудшить качество и количество белков выражается в отдельных волокон. Мы убедились, что реализация методологии, описанной в этой статье приводит к высоким выходом растворимые белки, т.е. EGFP и ECFP<sup> 3</sup>, Кальпаин, FKBP12, β2a-DHPR и т.д.; структурные белки, т.е. minidystrophin и α-актинина; и мембранных белков, то есть α1s-DHPR, RyR1, сердечная Na / Ca<sup> 2 +</sup> Теплообменник, NaV1.4 Na канал, SERCA1 и т.д., при нанесении на FDB, И. О. и других мышц мышей и крыс. Эффективное выражение некоторых из этих белков была проверена с биохимическими<sup> 3</sup> И функциональных доказательств<sup> 5</sup>. Тем не менее, на сегодняшний день наиболее распространенными подтверждающего подход, используемый нами стандартных флуоресцентной микроскопии и 2-фотон лазерной сканирующей микроскопии (TPLSM), которые позволяют выявить не только общие выражения, но и подробные внутриклеточной локализации, флуоресцентно меткой конструкций белка. Метод может быть в равной степени использоваться для трансфекции плазмиды кодировки для экспрессии белков физиологических релевантности (как показано на рисунке), или для РНК-интерференции (миРНК), направленных для подавления экспрессии обычно выражается белков (не проверялась нами пока). Следует отметить, что трансфекции волокон FDB и IO мышц имеет особое значение для исследования физиологии млекопитающих, так как волокна мышц ферментативно отделены от этих мышц в настоящее время одним из наиболее подходящих моделей для исследования основных механизмов сцепления возбудимость и возбуждение-сжатия под тока или напряжения условия зажим<sup> 2,6-8</sup>.
Protocol
Discussion
Мы описываем здесь подробные шаги, которые следует соблюдать, чтобы достичь эффективной трансфекции ДНК плазмиды в скелетные мышечные волокна путем в естественных условиях электропорации. Основные преимущества нашего подхода являются простота реализации и ее минимальная инваз…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-р Т. Отис, Департамент нейробиологии, UCLA, для обмена TPLSM объекта с нами, д-р К. Fahlke, Институт физиологии, Аахена, Германия, за добрые пожертвования pEYFP-ClC1 плазмиды, и г-н . Р. Серрано для технической поддержки. Эта работа была поддержана грантами NIH / NIAMS гранты AR047664 и AR54816.
References
- Muangmoonchai, R., Wong, S., Smirlis, D., Phillips, I., Shephard, E. Transfection of liver in vivo by biolistic particle delivery. Molecular Biotechnology. 20 (2), 145-151 (2002).
- DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. Voltage-dependent dynamic FRET signals from the transverse tubules in mammalian skeletal muscle fibers. J Gen Physiol. 130 (6), 581-600 (2007).
- DiFranco, M., Neco, P., Capote, J., Meera, P., Vergara, J. L. Quantitative evaluation of mammalian skeletal muscle as a heterologous protein expression system. Protein Expression and Purification. 47 (1), 281-288 (2006).
- Meera, P., Dodson, P. D., Karakossian, M. H., Otis, T. S. Expression of GFP-tagged neuronal glutamate transporters in cerebellar Purkinje neurons. Neuropharmacology. 49 (6), 883-889 (2005).
- DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. Dynamic FRET Signals between DPA and the {alpha}1s and {beta}1a Subunits of the DHPR of Mammalian Skeletal Muscle. Biophys. J. 94, 2633-2633 (2008).
- Woods, C. E., Novo, D., DiFranco, M., Capote, J., Vergara, J. L. Propagation in the transverse tubular system and voltage dependence of calcium release in normal and mdx mouse muscle fibres. J Physiol. 568 (Pt 3), 867-880 (2005).
- DiFranco, M., Woods, C. E., Capote, J., Vergara, J. L. Dystrophic skeletal muscle fibers display alterations at the level of calcium microdomains. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38), 14698-14703 (2008).
- Lueck, J. D., Mankodi, A., Swanson, M. S., Thornton, C. A., Dirksen, R. T. Muscle Chloride Channel Dysfunction in Two Mouse Models of Myotonic Dystrophy. J. Gen. Physiol. 129 (1), 79-94 (2007).
- Zipfel, W. R. Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7075-7080 (2003).
- Plotnikov, S. V., Millard, A. C., Campagnola, P. J., Mohler, W. A. Characterization of the Myosin-Based Source for Second-Harmonic Generation from Muscle Sarcomeres. Biophys J. 90 (2), 693-703 (2006).
- DiFranco, M., Capote, J., Vergara, J. L. Optical imaging and functional characterization of the transverse tubular system of mammalian muscle fibers using the potentiometric indicator di-8-ANEPPS. J Membr Biol. 208 (2), 141-153 (2005).
- Mills, M. Differential expression of the actin-binding proteins, {{alpha}}-actinin-2 and -3, in different species: implications for the evolution of functional redundancy. Hum. Mol. Genet. 10 (13), 1335-1346 (2001).
- Woods, C. E., Novo, D., DiFranco, M., Vergara, J. L. The action potential-evoked sarcoplasmic reticulum calcium release is impaired in mdx mouse muscle fibres. J Physiol. 557 (Pt 1), 59-75 (2004).
