DNA Transfektion von Säuger Skelettmuskulatur mit In Vivo Elektroporation
Summary
Wir beschreiben detaillierte Verfahren für die effiziente Transfektion von Plasmid-DNA in die Fasern der Fußmuskulatur von lebenden Mäusen mittels Elektroporation und der nachfolgenden Darstellung der Proteinexpression mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie.
Abstract
Ein wachsendes Interesse in der Zellbiologie ist transgen zu veränderten Formen der essentiellen Proteine (zB fluoreszenzmarkierten Konstrukte und / oder mutierte Varianten) auszudrücken, um ihre endogene Verteilung und funktionelle Bedeutung zu untersuchen. Ein interessanter Ansatz, der umgesetzt wurde, um dieses Ziel in ausdifferenzierten Zellen erfüllen, ist der<em> In vivo</em> Transfektion von Plasmiden durch verschiedene Methoden in bestimmten Geweben wie Leber<sup> 1</sup>, Skelettmuskel<sup> 2,3</sup>, Und sogar das Gehirn<sup> 4</sup>. Wir stellen Ihnen hier eine detaillierte Beschreibung der Schritte, die befolgt werden, um effizient transfizieren genetischen Materials in die Fasern der muss<em> Flexor digitorum brevis</em> (FDB) und<em> Interosseus</em> (IO) Muskeln des erwachsenen Mäusen mit einem<em> In vivo</em> Elektroporation Ansatz. Die experimentellen Parameter wurden so die Anzahl der Muskelfasern transfizierten gleichzeitiger Minimierung Gewebeschäden, dass die Qualität und Quantität der Proteine in einzelnen Fasern ausgedrückt beeinträchtigen maximieren optimiert. Wir haben überprüft, dass die Umsetzung der Methodik in diesem Papier beschrieben in einer hohen Ausbeute an löslichen Proteinen, dh EGFP und ECFP Ergebnisse<sup> 3</sup>, Calpain, FKBP12, β2a-DHPR, etc.; Strukturproteine, dh minidystrophin und α-Actinin und Membranproteine, dh α1s-DHPR, RyR1, kardiale Na / Ca<sup> 2 +</sup> Wärmetauscher, NaV1.4 Na-Kanal, SERCA1, etc., wenn sie auf FDB, IO und andere Muskeln von Mäusen und Ratten angewendet. Die effiziente Expression einiger dieser Proteine mit biochemischen überprüft<sup> 3</sup> Und funktionellen Nachweis<sup> 5</sup>. Allerdings sind bei weitem die häufigste bestätigenden Ansatz von uns verwendeten Standard-Fluoreszenz-Mikroskopie und 2-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie (TPLSM), die nicht nur die allgemeine Ausdruck zu identifizieren lassen, sondern auch die detaillierte intrazelluläre Lokalisation von fluoreszenzmarkierten Protein-Konstrukten. Die Methode könnte auch genutzt werden, um Plasmide, die für die Expression von Proteinen der physiologischen Relevanz (wie hier) zu transfizieren, oder für RNA-Interferenz (siRNA) mit dem Ziel, die Expression von normalerweise exprimierten Proteine (nicht von uns getestet) zu unterdrücken. Anzumerken ist, dass die Transfektion von FDB und IO Muskelfasern besonders relevant ist für die Untersuchung von Säugetieren Muskelphysiologie seit Fasern enzymatisch losgelöst von diesen Muskeln derzeit einer der am besten geeigneten Modelle zur grundlegenden Mechanismen der Erregbarkeit und Erregung und Kontraktion unter untersuchen Strom oder Spannung Klemme Bedingungen<sup> 2,6-8</sup>.
Protocol
Discussion
Wir beschreiben hier die einzelnen Schritte, die folgten, um eine effektive Transfektion von DNA-Plasmiden in Skelettmuskelfasern erreichen durch in vivo Elektroporation werden sollte. Die wesentlichen Vorteile unseres Ansatzes sind die Einfachheit der Implementierung und ihrer minimalen Invasivität, die in vernachlässigbarer Gefahr für die Gesundheit der Tiere führt. In Wirklichkeit haben die oben beschriebene Elektroporation Protokolle nicht erfordert weit mehr als zwei subkutane Injektionen pro Fuß, dur…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. T. Otis, Department für Neurobiologie, UCLA, für die gemeinsame Nutzung der TPLSM Anlage mit uns, Dr. C. Fahlke, Institut für Physiologie, RWTH Aachen, Deutschland, für die freundliche Spende der pEYFP-ClC1 Plasmid, und Herr . R. Serrano für den technischen Support. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von NIH / NIAMS gewährt AR047664 und AR54816 unterstützt.
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