사용 포유류 골격 근육의 유전자 Transfection VIVO에서 Electroporation
Summary
우리는 electroporation과 형광 현미경을 사용하여 단백질 표현의 후속 시각화를 사용하여 라이브 생쥐의 발 근육의 섬유에 플라스미드 DNA의 transfection 효율에 대한 자세한 절차를 설명합니다.
Abstract
세포 생물학에 관심이 점점 자신의 내생적인 분포와 기능 관련을 조사하기 위해 필수적인 단백질 (예 : 찬란 태그를 구성 및 / 또는 돌연변이 변종)의 transgenically 수정된 형태를 표현하는 것입니다. 완전히 차별화된 세포에서이 목표를 성취하기 위해 구현되었습니다 흥미로운 접근 방식입니다<em> 생체내에</em같은 간장과 같은 특정 조직에 다양한 방법으로 plasmids의> transfection<sup> 1</sup>, 골격근<sup> 2,3</sup>, 그리고 심지어 두뇌<sup> 4</sup>. 우리는 여기서 효율적으로의 섬유로 유전 물질을 transfect하기 위해 따라야합니다 단계에 대한 자세한 설명을 제시<em> flexor digitorum brevis</em> (FDB)와<em> interosseus</em를 사용하여 성인 마우스> (IO) 근육<em> 생체내에</em> electroporation 접근. 실험 매개 변수는 각각의 섬유로 표현 단백질의 품질과 수량을 손상 수 있습니다 조직 손상을 최소화하면서 transfected 근육 섬유의 수를 최대화하기 위해처럼 최적화되었습니다. 우리는이 문서에서 설명하는 방법의 구현 수용성 단백질의 높은 수율, 즉 EGFP와 ECFP 결과 확인했습니다<sup> 3</sup> calpain, FKBP12, β2a – DHPR 등, 구조 단백질, 즉 minidystrophin과 α – actinin 및 막 단백질, 즉 α1s – DHPR, RyR1, 심장 나 / CA<sup> 2 +</supFDB, IO와 생쥐와 쥐의 다른 근육에 적용> 교환기, NaV1.4 나 채널, SERCA1 등. 이러한 단백질 중 일부의 효율적인 표현은 생화학과 함께 확인되었습니다<sup> 3</sup> 및 기능 증거<sup> 5</sup>. 그러나, 훨씬 우리가 사용하는 가장 일반적인 확실한 방법은 찬란 태그 단백질 구조의 표준 형광 현미경 및 2 광자 레이저 스캔 현미경 (TPLSM), 전반적인 표현뿐만 아니라 식별하도록 허용뿐만 아니라 세부적인 세포 로컬 리 제이션은 다음과 같습니다. 방법은 동일합니다 (여기에 표시) 생리 관련의 단백질의 표현을위한 인코딩 plasmids를 transfect하는 데 사용하거나, 간섭 RNA (siRNA)를 일반적으로 표현 단백질 (아직 저희가 테스트하지)의 표현을 억제하는 목표 수 있습니다. 그것은이 근육의 효소 dissociated 섬유 아래는 흥분하고 여기 – 수축 결합의 기본 메커니즘을 조사하기 위해 현재 가장 적합한 모델 중 하나이기 때문에 FDB 및 IO 근육 섬유의 transfection은 포유류의 근육 생리학의 조사에 특히 관련이 있다고 지적한다 전류 또는 전압 클램프 조건<sup> 2,6-8</sup>.
Protocol
Discussion
우리는 여기서 생체내의 electroporation에 의해 골격 근육 섬유로의 DNA plasmids 효과 transfections을 달성하기 위해 따라야 할 자세한 단계를 설명합니다. 우리의 접근 방법의 주요 장점은 구현의 단순하고, 동물 무시할 건강 위험의 결과는 최소한의 invasiveness 있습니다. 현실에서는, 위에서 설명한 electroporation 프로토콜은 마취에서 동물에 의해 잘 용납하는 모든 중 전기 자극 프로토콜에 의해 뒤에…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 우리와 함께 TPLSM 시설을 공유 박사 T. 오티스, 신경 생물학, UCLA의 부, 감사, 박사 C. pEYFP – ClC1 플라스미드의 종류 기증 Fahlke, 생리학 연구소, RWTH 아헨, 독일, 그리고 미스터 기술 지원. R. 세라노. 이 작품은 NIH / NIAMS 부여 AR047664과 AR54816의 보조금에 의해 지원되었다.
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