DNA Transfectie van zoogdieren skeletspieren met behulp van In Vivo Elektroporatie
Summary
We beschrijven gedetailleerde procedures voor de efficiënte transfectie van plasmide DNA in de vezels van mond spieren van levende muizen met behulp van elektroporatie en de daaropvolgende visualisatie van eiwitexpressie met behulp van fluorescentie microscopie.
Abstract
Een groeiende interesse in de celbiologie is transgenically gemodificeerde vormen van essentiële eiwitten (bv. fluorescent gelabelde bouwt en / of gemuteerde varianten) te drukken om hun endogene distributie en functionele relevantie te onderzoeken. Een interessante benadering die is ingevoerd om deze doelstelling te voldoen volledig gedifferentieerde cellen is de<em> In vivo</em> Transfectie van plasmiden met verschillende methoden in specifieke weefsels zoals de lever<sup> 1</sup>, Skeletspieren<sup> 2,3</sup>, En zelfs de hersenen<sup> 4</sup>. We presenteren hier een gedetailleerde beschrijving van de stappen die moeten worden gevolgd om genetisch materiaal efficiënt transfecteren in vezels van de<em> Flexor digitorum brevis</em> (FDB) en<em> Interosseus</em> (IO) spieren van volwassen muizen met behulp van een<em> In vivo</em> Elektroporatie aanpak. De experimentele parameters zijn geoptimaliseerd is om het aantal spiervezels getransfecteerd terwijl het minimaliseren van weefsel schade die de kwaliteit en kwantiteit van de eiwitten, uitgedrukt in individuele vezels kunnen aantasten te maximaliseren. We hebben geverifieerd dat de implementatie van de methodiek beschreven in dit document resulteert in een hoge opbrengst van oplosbare eiwitten, dat wil zeggen EGFP en ECFP<sup> 3</sup>, Calpaïne, FKBP12, β2a-DHPR, enz.; structurele eiwitten, dat wil zeggen minidystrophin en α-actinine, en membraaneiwitten, dat wil zeggen α1s-DHPR, RyR1, cardiale Na / Ca<sup> 2 +</sup> Warmtewisselaar, NaV1.4 Na kanaal, SERCA1, enz., wanneer toegepast op FDB, IO en andere spieren van muizen en ratten. De efficiënte expressie van sommige van deze eiwitten is geverifieerd met biochemische<sup> 3</sup> En functionele aanwijzingen<sup> 5</sup>. Echter, veruit de meest voorkomende bevestiging benadering door ons gebruikt zijn standaard fluorescentie microscopie en twee-foton laser scanning microscopie (TPLSM), die toelaten om niet alleen de totale expressie te identificeren, maar ook de gedetailleerde intracellulaire lokalisatie van fluorescent gelabelde eiwitten constructen. De methode kan ook worden gebruikt om de plasmiden die coderen voor de expressie van eiwitten van fysiologische relevantie (zoals hier afgebeeld) transfecteren, of voor interferentie RNA (siRNA) gericht op de expressie van normaal tot expressie gebrachte eiwitten (niet door ons getest nog) niet te onderdrukken. Opgemerkt moet worden dat de transfectie van FDB en IO spiervezels is bijzonder relevant voor het onderzoek van zoogdieren spierfysiologie sinds vezels enzymatisch los te zien van deze spieren zijn op dit moment een van de meest geschikte modellen om de basismechanismen van prikkelbaarheid en excitatie-contractie koppeling te onderzoeken onder stroom of spanning klem voorwaarden<sup> 2,6-8</sup>.
Protocol
Discussion
We beschrijven hier de gedetailleerde stappen die gevolgd moeten worden om een doeltreffende transfecties van DNA plasmiden te bereiken in de skeletspier vezels door in vivo elektroporatie. De belangrijkste voordelen van onze aanpak zijn de eenvoud van de uitvoering, en de minimale invasiviteit, wat resulteert in verwaarloosbare gezondheidsrisico voor de dieren. In werkelijkheid, zijn de hierboven beschreven elektroporatie protocollen niet leiden tot veel meer dan twee subcutane injecties per voet, gevolgd door…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken dr. T. Otis, afdeling Neurobiologie, UCLA, voor het delen van de TPLSM faciliteit met ons, dr. C. Fahlke, Instituut voor Fysiologie, RWTH Aachen, Duitsland, voor het soort schenking van de pEYFP-ClC1 plasmide, en de heer . R. Serrano voor technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door subsidies van NIH / NIAMS beurzen AR047664 en AR54816.
References
- Muangmoonchai, R., Wong, S., Smirlis, D., Phillips, I., Shephard, E. Transfection of liver in vivo by biolistic particle delivery. Molecular Biotechnology. 20 (2), 145-151 (2002).
- DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. Voltage-dependent dynamic FRET signals from the transverse tubules in mammalian skeletal muscle fibers. J Gen Physiol. 130 (6), 581-600 (2007).
- DiFranco, M., Neco, P., Capote, J., Meera, P., Vergara, J. L. Quantitative evaluation of mammalian skeletal muscle as a heterologous protein expression system. Protein Expression and Purification. 47 (1), 281-288 (2006).
- Meera, P., Dodson, P. D., Karakossian, M. H., Otis, T. S. Expression of GFP-tagged neuronal glutamate transporters in cerebellar Purkinje neurons. Neuropharmacology. 49 (6), 883-889 (2005).
- DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. Dynamic FRET Signals between DPA and the {alpha}1s and {beta}1a Subunits of the DHPR of Mammalian Skeletal Muscle. Biophys. J. 94, 2633-2633 (2008).
- Woods, C. E., Novo, D., DiFranco, M., Capote, J., Vergara, J. L. Propagation in the transverse tubular system and voltage dependence of calcium release in normal and mdx mouse muscle fibres. J Physiol. 568 (Pt 3), 867-880 (2005).
- DiFranco, M., Woods, C. E., Capote, J., Vergara, J. L. Dystrophic skeletal muscle fibers display alterations at the level of calcium microdomains. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38), 14698-14703 (2008).
- Lueck, J. D., Mankodi, A., Swanson, M. S., Thornton, C. A., Dirksen, R. T. Muscle Chloride Channel Dysfunction in Two Mouse Models of Myotonic Dystrophy. J. Gen. Physiol. 129 (1), 79-94 (2007).
- Zipfel, W. R. Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7075-7080 (2003).
- Plotnikov, S. V., Millard, A. C., Campagnola, P. J., Mohler, W. A. Characterization of the Myosin-Based Source for Second-Harmonic Generation from Muscle Sarcomeres. Biophys J. 90 (2), 693-703 (2006).
- DiFranco, M., Capote, J., Vergara, J. L. Optical imaging and functional characterization of the transverse tubular system of mammalian muscle fibers using the potentiometric indicator di-8-ANEPPS. J Membr Biol. 208 (2), 141-153 (2005).
- Mills, M. Differential expression of the actin-binding proteins, {{alpha}}-actinin-2 and -3, in different species: implications for the evolution of functional redundancy. Hum. Mol. Genet. 10 (13), 1335-1346 (2001).
- Woods, C. E., Novo, D., DiFranco, M., Vergara, J. L. The action potential-evoked sarcoplasmic reticulum calcium release is impaired in mdx mouse muscle fibres. J Physiol. 557 (Pt 1), 59-75 (2004).
