ה-DNA transfection של שרירי השלד היונקים באמצעות In vivo Electroporation
Summary
אנו מתארים נהלים מפורטים transfection היעילה של DNA פלסמיד לתוך הסיבים של שרירי כף הרגל של עכברים חיים באמצעות electroporation ואת להדמיה הבאות של ביטוי חלבון באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
Abstract
עניין גובר בביולוגיה של התא היא להביע צורות transgenically שונה של חלבונים חיוניים (למשל בונה מתויג fluorescently ו / או וריאנטים מוטנטיים) על מנת לחקור הפצה אנדוגניים שלהם ואת הרלוונטיות תפקודית. גישה מעניינת כי יושם להגשים מטרה זו בתאים הבדיל באופן מלא הוא<em> In vivo</em> Transfection של פלסמידים על ידי שיטות שונות לתוך רקמות ספציפיות כגון הכבד<sup> 1</sup>, שרירי השלד<sup> 2,3</sup>, וגם את המוח<sup> 4</sup>. אנו מציגים כאן תיאור מפורט של הצעדים שיש אחריו על מנת ביעילות transfect החומר הגנטי לתוך סיבי של<em> Flexor digitorum brevis</em> (FDB) ו<em> Interosseus</em> (IO) בשרירים של עכברים מבוגרים באמצעות<em> In vivo</em> גישה electroporation. הפרמטרים ניסיוני מוטבו כדי למקסם את מספר סיבי השריר transfected תוך מזעור הנזק לרקמות שעשוי לפגום באיכות וכמות החלבונים המתבטאת סיבים בודדים. יש לנו אומת כי יישום המתודולוגיה המתוארת במאמר זה תוצאות תשואה גבוהה של חלבונים מסיסים, כלומר EGFP ו ECFP<sup> 3</sup>, Calpain, FKBP12, β2a-DHPR, וכו '; חלבונים מבניים, כלומר minidystrophin ו α-actinin וכן חלבונים בממברנה, כלומר α1s-DHPR, RyR1, לב Na / Ca<sup> 2 +</sup> מחליף, NaV1.4 Na הערוץ, SERCA1 וכו ', כשהם מיושמים FDB, IO ושרירים אחרים של עכברים וחולדות. הביטוי יעיל של כמה חלבונים אלה אומת עם ביוכימיים<sup> 3</sup> ופונקציונלי ראיות<sup> 5</sup>. עם זאת, ספק גישה מאשרות הנפוצים ביותר בשימוש על ידי מאיתנו מיקרוסקופ פלואורסצנטי רגיל 2-פוטון מיקרוסקופית סריקת לייזר (TPLSM), המאפשרים לזהות לא רק את הביטוי הכללי, אלא גם לוקליזציה תאיים מפורט, של החלבון בונה מתויג fluorescently. השיטה יכולה לשמש באותה מידה transfect פלסמידים קידוד לביטוי של חלבונים הרלוונטיות פיזיולוגיים (כפי שמוצג כאן), או התערבות RNA (siRNA) במטרה לדכא את הביטוי של חלבונים הביעו בדרך כלל (לא נבדק על ידינו עדיין). יצוין כי transfection של סיבי שריר FDB ו IO רלוונטי במיוחד עבור חקירת הפיזיולוגיה שריר יונקים מאז סיבי enzymatically ניתק מן השרירים הללו כיום אחד הדגמים הכי מתאים לחקור את המנגנונים הבסיסיים של צימוד עירור רגישות ו-התכווצות תחת מהדק התנאים הנוכחיים או מתח<sup> 2,6-8</sup>.
Protocol
Discussion
אנו מתארים כאן את הצעדים מפורט כי יש לפעול כדי להשיג transfections יעיל של פלסמידים DNA לתוך סיבי שריר השלד על ידי electroporation ב vivo. היתרונות העיקריים של הגישה שלנו הן את הפשטות של היישום, הפולשנות שלו מינימלית שתוצאתה סיכון בריאותי זניח לבעלי החיים. במציאות, פרוטוקולים מעל …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד"ר ט אוטיס, המחלקה לנוירוביולוגיה, UCLA, לשיתוף מתקן TPLSM איתנו, ד"ר ג Fahlke, המכון לפיזיולוגיה, RWTH אאכן, גרמניה, על התרומה סוג של pEYFP-ClC1 פלסמיד, ומר . ר סראנו לקבלת תמיכה טכנית. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ-NIH / NIAMS מענקים AR047664 ו AR54816.
References
- Muangmoonchai, R., Wong, S., Smirlis, D., Phillips, I., Shephard, E. Transfection of liver in vivo by biolistic particle delivery. Molecular Biotechnology. 20 (2), 145-151 (2002).
- DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. Voltage-dependent dynamic FRET signals from the transverse tubules in mammalian skeletal muscle fibers. J Gen Physiol. 130 (6), 581-600 (2007).
- DiFranco, M., Neco, P., Capote, J., Meera, P., Vergara, J. L. Quantitative evaluation of mammalian skeletal muscle as a heterologous protein expression system. Protein Expression and Purification. 47 (1), 281-288 (2006).
- Meera, P., Dodson, P. D., Karakossian, M. H., Otis, T. S. Expression of GFP-tagged neuronal glutamate transporters in cerebellar Purkinje neurons. Neuropharmacology. 49 (6), 883-889 (2005).
- DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. Dynamic FRET Signals between DPA and the {alpha}1s and {beta}1a Subunits of the DHPR of Mammalian Skeletal Muscle. Biophys. J. 94, 2633-2633 (2008).
- Woods, C. E., Novo, D., DiFranco, M., Capote, J., Vergara, J. L. Propagation in the transverse tubular system and voltage dependence of calcium release in normal and mdx mouse muscle fibres. J Physiol. 568 (Pt 3), 867-880 (2005).
- DiFranco, M., Woods, C. E., Capote, J., Vergara, J. L. Dystrophic skeletal muscle fibers display alterations at the level of calcium microdomains. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38), 14698-14703 (2008).
- Lueck, J. D., Mankodi, A., Swanson, M. S., Thornton, C. A., Dirksen, R. T. Muscle Chloride Channel Dysfunction in Two Mouse Models of Myotonic Dystrophy. J. Gen. Physiol. 129 (1), 79-94 (2007).
- Zipfel, W. R. Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7075-7080 (2003).
- Plotnikov, S. V., Millard, A. C., Campagnola, P. J., Mohler, W. A. Characterization of the Myosin-Based Source for Second-Harmonic Generation from Muscle Sarcomeres. Biophys J. 90 (2), 693-703 (2006).
- DiFranco, M., Capote, J., Vergara, J. L. Optical imaging and functional characterization of the transverse tubular system of mammalian muscle fibers using the potentiometric indicator di-8-ANEPPS. J Membr Biol. 208 (2), 141-153 (2005).
- Mills, M. Differential expression of the actin-binding proteins, {{alpha}}-actinin-2 and -3, in different species: implications for the evolution of functional redundancy. Hum. Mol. Genet. 10 (13), 1335-1346 (2001).
- Woods, C. E., Novo, D., DiFranco, M., Vergara, J. L. The action potential-evoked sarcoplasmic reticulum calcium release is impaired in mdx mouse muscle fibres. J Physiol. 557 (Pt 1), 59-75 (2004).
