Isolamento e derivação de células embrionárias de rato Germinal
Summary
A capacidade de células germinais embrionárias de se diferenciarem em células germinativas primordiais durante estágios iniciais de desenvolvimento é um modelo perfeito para abordar nossa hipótese sobre o câncer e infertilidade. Este protocolo mostra como isolar células germinativas primordiais das gônadas em desenvolvimento 10,5-11,5 dias após a embriões de camundongos coitum.
Abstract
A capacidade de células germinais embrionárias (EG) de se diferenciar em células germinativas primordiais (PGCs) e mais tarde em gametas durante as primeiras fases de desenvolvimento é um modelo perfeito para resolver a nossa hipótese sobre o câncer e infertilidade. Este protocolo mostra como isolar células germinativas primordiais das gônadas em desenvolvimento 10,5-11,5 dias pós coitum embriões (DPC) do mouse. Desenvolvimento gonadal cumes de embriões de camundongos (C57BL6J) foram dissociadas pela ruptura mecânica com colagenase, então banhado em um rato camada de alimentador de embrião de fibroblastos (MEF-CF1) que foi previamente mitoticamente inativada com mitomicina C na presença de mídia nocaute e suplementada com inibidor de leucemia fator (LIF), fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF) e fator de Stem Cell (SCF). Usando esses métodos otimizados para a identificação PCG, isolamento e estabelecimento de condições de cultura permite culturas de longo prazo de células EG por mais de 40 dias. O embrionárias linhagens de células germinais embrionárias mostrou fenótipo e expressão de marcadores utilizados comum do estado pluripotente. Isolamento e derivação de células germinais na cultura fornecer uma ferramenta para entender o seu desenvolvimento in vitro e oferecer a oportunidade de acompanhar os danos cumulativos ao nível genético e epigenético após a exposição ao estresse oxidativo.
Protocol
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a ajuda inestimável de: Dr. Neal First e Kourtney Wilkinson para manuscrito edição; Dr Lucy Senter, Dr. Brigit Willeford e Mike Basett de assistência com a formação e animal cuidados na instalação do mouse MSU ALAC credenciados; Dr. Dwayne Sábio por sua assistência com microscopia e captura de imagem; Cesar Monroy, Hannah Swoope, e Bobbie Huddleston por sua assistência com a produção de vídeo na MSU. Esta pesquisa foi financiada pelo Instituto de Pesquisa Institucional e do Departamento de Ciências Biológicas da Mississippi State University.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 10.5 – 11.5 dpc pregnant C57BL6J female mouse crossed with the same background male mouse. | ||||
| Mouse Fibroblast MEF-CF1 ATCC | SCRC-1040 | |||
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Invitrogen | 14190/086 | ||
| Collagenase /Dispase Solution | Roche | 269638 | ||
| Gelatin | Sigma | G1890 | ||
| Mitomycin C | Sigma | M4287 | ||
| Trypsin EDTA | Invitrogen | 25200-072 | ||
| MEF Medium: Dulbecco Medium Eagle Modified (D-MEM) GLUTAMAX High glucose | Invitrogen | 10566024 | ||
| 10% Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16000/044 | ||
| 1% of antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15420/096 | ||
| Knockout Media: 80% knockout D-MEM | Invitrogen | 10829/018 | ||
| 20% Knockout serum Invitrogen Cat. No. 1028/028, 200mM L-glutamine Invitrogen | 25130/081 | with β-mercaptoethanol Sigma Catalogue Number: M7522 | ||
| 1X non essential amino acid solution | Invitrogen | 11140/050 | ||
| 1% antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15420/096 | supplemented with grow factor as 2500 U of Leukemia inhibitory factor (mLIF-ESGRO) Millipore Catalogue Number: ESG1106 | |
| 40 ng/ml of Recombinant Murine Stem Cell Factor (SCF) ReproTech | 250-03 | |||
| 20 ng/ml of Basic Fibroblast Growth factor (bFGF) | Invitrogen | 13256-029 | ||
| Corning center well culture dish 60mm | Fisher | 07-200-79 | 1.5 ml eppendorf tube, and 15 ml falcon tubes |
Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet.
Referências
- DeFelici, M. . Cell Biology: A laboratory Handbook. 1, 73-85 (1998).
- Donovan, P. J., De Miguel, M. P. Turning Germ Cells into Stem Cells. Current Opinion in Genetics and Development. 13, 463-471 (2003).
- Labosky, P. A., Hogan, B. L. M., Sharp, P. T., Mason, I. Part 12: Mouse Primordial Germ Cells: isolation and in vitro culture. Molecular embryology: methods and protocols. 97, (1999).
- Mc Laren, A., Southee, D. Entry of Mouse Embryonic Germ Cells into Meiosis. Biologia do Desenvolvimento. 187, 107-113 (1997).
- Yoshimizu, T., Obinata, M., Matsui, Y. Stage-specific tissue and cell interactions play key roles in mouse germ cell specification. Development. 128, 481-490 (2001).
- Zhang, J., Hhvorostov, I., Teitell, M. From MEFs to Matrigel I: Passaging hESCs in the Presence of MEFs. J Vis Exp. , (2008).
