בידוד גזירת תאים עובריים בעכבר ז'רמינל
Summary
היכולת של תאים עובריים נבטי להתמיין לתאי נבטי קדמוני בשלבי הפיתוח המוקדמים הוא מודל מושלם לכתובת ההשערה שלנו לגבי סרטן פוריות. פרוטוקול זה מראה כיצד לבודד תאים נבטי קדמוני של בלוטות המין המתפתחות 10.5-11.5 ימים coitum עוברים לפרסם העכבר.
Abstract
היכולת של תאים עובריים נבטי (למשל) כדי להתמיין לתאי נבטי קדמוני (PGCs) ומאוחר יותר לתוך הגמטות במהלך שלבי ההתפתחות המוקדמים הוא מודל מושלם לכתובת ההשערה שלנו לגבי סרטן פוריות. פרוטוקול זה מראה כיצד לבודד תאים נבטי קדמוני של בלוטות המין המתפתחות 10.5-11.5 בימים שלאחר coitum (DPC) עוברי עכברים. פיתוח רכסים האשכים מעוברים העכבר (C57BL6J) היו מנותקים על ידי הפרעה מכנית עם collagenase, אז מצופה שכבה העובר עכבר מזין פיברובלסטים (MEF-CF1) כי היה בעבר מומת mitotically בנוכחות התקשורת בנוקאאוט עם mitomycin C שיושלם עם מעכבי לוקמיה פקטור (LIF), פיברובלסטים בסיסי גורם הגדילה (bFGF), וכן גורם לתאי גזע (SCF). שימוש בשיטות אלה אופטימיזציה עבור זיהוי ובידוד PCG, והקמת התנאים תרבות היתרי תרבויות ארוך טווח של תאים EG במשך יותר מ 40 ימים. הקווים עובריים נבטי הראו פנוטיפ הביטוי עובריים של סמנים בשימוש משותף של המדינה pluripotent. בידוד הגזירה של תאים נבטי בתרבות לספק כלי להבין את התפתחותם במבחנה מציעים את ההזדמנות כדי לפקח על נזק מצטבר ברמות גנטיים epigenetic לאחר חשיפה סטרס חמצוני.
Protocol
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להכיר לעזור יסולא בפז של: ד"ר ניל הראשונה Kourtney וילקינסון עבור עריכת כתב היד, ד"ר לוסי Senter, ד"ר Brigit Willeford ומייק Basett לסיוע בטיפול הדרכה חיה במתקן ALAC MSU העכבר מוכר; ד"ר דוויין וייז עבור עזרתו עם מיקרוסקופיה לכידת תמונה: סזאר מונרוי, חנה Swoope, ובובי Huddleston על עזרתם עם ייצור וידאו MSU. מחקר זה מומן על ידי משרד המחקר המוסדיים ואת המחלקה למדעי הביולוגיה על מיסיסיפי סטייט.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 10.5 – 11.5 dpc pregnant C57BL6J female mouse crossed with the same background male mouse. | ||||
| Mouse Fibroblast MEF-CF1 ATCC | SCRC-1040 | |||
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Invitrogen | 14190/086 | ||
| Collagenase /Dispase Solution | Roche | 269638 | ||
| Gelatin | Sigma | G1890 | ||
| Mitomycin C | Sigma | M4287 | ||
| Trypsin EDTA | Invitrogen | 25200-072 | ||
| MEF Medium: Dulbecco Medium Eagle Modified (D-MEM) GLUTAMAX High glucose | Invitrogen | 10566024 | ||
| 10% Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16000/044 | ||
| 1% of antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15420/096 | ||
| Knockout Media: 80% knockout D-MEM | Invitrogen | 10829/018 | ||
| 20% Knockout serum Invitrogen Cat. No. 1028/028, 200mM L-glutamine Invitrogen | 25130/081 | with β-mercaptoethanol Sigma Catalogue Number: M7522 | ||
| 1X non essential amino acid solution | Invitrogen | 11140/050 | ||
| 1% antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15420/096 | supplemented with grow factor as 2500 U of Leukemia inhibitory factor (mLIF-ESGRO) Millipore Catalogue Number: ESG1106 | |
| 40 ng/ml of Recombinant Murine Stem Cell Factor (SCF) ReproTech | 250-03 | |||
| 20 ng/ml of Basic Fibroblast Growth factor (bFGF) | Invitrogen | 13256-029 | ||
| Corning center well culture dish 60mm | Fisher | 07-200-79 | 1.5 ml eppendorf tube, and 15 ml falcon tubes |
Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet.
Referências
- DeFelici, M. . Cell Biology: A laboratory Handbook. 1, 73-85 (1998).
- Donovan, P. J., De Miguel, M. P. Turning Germ Cells into Stem Cells. Current Opinion in Genetics and Development. 13, 463-471 (2003).
- Labosky, P. A., Hogan, B. L. M., Sharp, P. T., Mason, I. Part 12: Mouse Primordial Germ Cells: isolation and in vitro culture. Molecular embryology: methods and protocols. 97, (1999).
- Mc Laren, A., Southee, D. Entry of Mouse Embryonic Germ Cells into Meiosis. Biologia do Desenvolvimento. 187, 107-113 (1997).
- Yoshimizu, T., Obinata, M., Matsui, Y. Stage-specific tissue and cell interactions play key roles in mouse germ cell specification. Development. 128, 481-490 (2001).
- Zhang, J., Hhvorostov, I., Teitell, M. From MEFs to Matrigel I: Passaging hESCs in the Presence of MEFs. J Vis Exp. , (2008).
