La capacità di cellule germinali embrionali di differenziarsi in cellule germinali primordiali durante le prime fasi di sviluppo è un modello perfetto per affrontare la nostra ipotesi sul cancro e la sterilità. Questo protocollo mostra come isolare le cellule germinali primordiali di gonadi in via di sviluppo 10,5-11,5 embrioni giorni post coitum mouse.
La capacità di cellule embrionali germinali (EG) a differenziarsi in cellule germinali primordiali (PGC) e più tardi in gameti durante le prime fasi di sviluppo è un modello perfetto per affrontare la nostra ipotesi sul cancro e la sterilità. Questo protocollo mostra come isolare le cellule germinali primordiali di gonadi in via di sviluppo 10,5-11,5 giorni post coitum (DPC), embrioni di topo. Lo sviluppo di creste delle gonadi da embrioni di topo (C57BL6J) erano dissociate dalla rottura meccanica con collagenasi, poi placcato in uno strato di fibroblasti di topo alimentatore embrione (MEF-CF1) che precedentemente era mitoticamente inattivati con mitomicina C in presenza di mezzi di comunicazione ad eliminazione diretta e integrata con Inibitore leucemia Factor (LIF), fondamentale fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF), e Stem Cell Factor (SCF). L'utilizzo di questi metodi di ottimizzazione per l'identificazione PCG, l'isolamento, e la creazione di condizioni di coltura permette di culture a lungo termine delle cellule EG per più di 40 giorni. Le linee sulle cellule germinali hanno mostrato fenotipo embrionale ed espressione di marcatori comuni usati dello stato pluripotente. L'isolamento e la derivazione di cellule germinali in coltura fornire uno strumento per comprendere il loro sviluppo in vitro e offrono la possibilità di monitorare i danni cumulativi a livelli genetici ed epigenetici dopo l'esposizione allo stress ossidativo.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori desiderano ringraziare per la preziosa collaborazione di: Dott. Neal First e Kourtney Wilkinson per il manoscritto di editing; Dr. Lucy Senter, il Dr. Brigit Willeford e Mike Basett per l'assistenza con cura la formazione e animali presso la struttura del mouse ALAC MSU accreditati; Dr. Dwayne Wise per la sua assistenza con la microscopia e la cattura dell'immagine; Cesar Monroy, Hannah Swoope, e Bobbie Huddleston per la loro assistenza con la produzione video a MSU. Questa ricerca è stata finanziata dall'Ufficio di ricerca istituzionale e il Dipartimento di Scienze Biologiche presso Mississippi State University.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
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10.5 – 11.5 dpc pregnant C57BL6J female mouse crossed with the same background male mouse. | ||||
Mouse Fibroblast MEF-CF1 ATCC | SCRC-1040 | |||
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Invitrogen | 14190/086 | ||
Collagenase /Dispase Solution | Roche | 269638 | ||
Gelatin | Sigma | G1890 | ||
Mitomycin C | Sigma | M4287 | ||
Trypsin EDTA | Invitrogen | 25200-072 | ||
MEF Medium: Dulbecco Medium Eagle Modified (D-MEM) GLUTAMAX High glucose | Invitrogen | 10566024 | ||
10% Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16000/044 | ||
1% of antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15420/096 | ||
Knockout Media: 80% knockout D-MEM | Invitrogen | 10829/018 | ||
20% Knockout serum Invitrogen Cat. No. 1028/028, 200mM L-glutamine Invitrogen | 25130/081 | with β-mercaptoethanol Sigma Catalogue Number: M7522 | ||
1X non essential amino acid solution | Invitrogen | 11140/050 | ||
1% antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15420/096 | supplemented with grow factor as 2500 U of Leukemia inhibitory factor (mLIF-ESGRO) Millipore Catalogue Number: ESG1106 | |
40 ng/ml of Recombinant Murine Stem Cell Factor (SCF) ReproTech | 250-03 | |||
20 ng/ml of Basic Fibroblast Growth factor (bFGF) | Invitrogen | 13256-029 | ||
Corning center well culture dish 60mm | Fisher | 07-200-79 | 1.5 ml eppendorf tube, and 15 ml falcon tubes |