قدرة الخلايا الجنينية جرثومي على التمايز إلى خلايا جرثومي البدائية خلال مراحل النمو المبكر هو نموذج مثالي لمعالجة فرضيتنا حول السرطان والعقم. هذا البروتوكول يوضح كيفية عزل خلايا جرثومي البدائية من المناسل النامية في الأجنة 10،5-11،5 أيام آخر coitum الماوس.
Abstract
قدرة الخلايا الجنينية جرثومي (مصر) على التمايز إلى خلايا بدائية جرثومي (PGCs) ولاحقا في الأمشاج خلال مراحل النمو المبكرة هو نموذج مثالي لمعالجة فرضيتنا حول السرطان والعقم. هذا البروتوكول يوضح كيفية عزل خلايا جرثومي البدائية من المناسل النامية في آخر أيام 10،5-11،5 الأجنة coitum الماوس (DPC). النامية التلال الغدد التناسلية من أجنة الفئران (C57BL6J) تم فصلها عن اضطراب الميكانيكية مع كولاجيناز ، ثم في مطلي بطبقة جنين الفأر تغذية الخلايا الليفية (MEF – CF1) الذي كان سابقا مع المعطل mitotically C mitomycin في حضور وسائل الإعلام وتستكمل مع خروج المغلوب المانع اللوكيميا عامل (LIF) ، عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF) ، والخلية الجذعية عامل (SCF). باستخدام هذه الأساليب الأمثل لتحديد PCG ، والعزلة ، وتهيئة الظروف ثقافة تصاريح الثقافات على المدى الطويل من الخلايا المصري لأكثر من 40 يوما. وأظهرت خطوط الخلايا الجنينية جرثومي النمط الظاهري الجنينية والتعبير عن علامات مشتركة تستخدم الدولة المحفزة. العزلة واشتقاق خلايا جرثومي في الثقافة توفير أداة لفهم تنميتها في المختبر ، وتتيح الفرصة لرصد الأضرار المتراكمة على المستويات الجينية واللاجينية بعد التعرض لالاكسدة.
Protocol
الجزء 1 : الحوامل البطن ماوس خلع به عنق الرحم ، والموت ببطء ماوس C57BL6J الإناث الحوامل في DPC 10،5-11،5. تنظيف البطن مع الصابون المضادة للميكروبات ، ثم حلقها. بعد الحلاقة ،…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أن نعترف مساعدة لا تقدر بثمن من : الدكتور نيل الأولى ويلكنسون Kourtney للتحرير المخطوط ، والدكتورة لوسي سنتر ، والدكتور Willeford بريجيت ومايك Basett للمساعدة في تدريب ورعاية الحيوان في جامعة ولاية ميشيغان مرفق ALAC الماوس المعتمدة ، والدكتور دواين وايز للحصول على المساعدة مع المجهري والتقاط الصور ؛ سيزار مونروي ، Swoope هانا ، وبوبي هدلستون لمساعدتها في إنتاج الفيديو في جامعة ولاية ميشيغان. وقد تم تمويل هذا البحث من قبل مكتب البحوث المؤسسية وإدارة العلوم البيولوجية في جامعة ولاية ميسيسيبي.
Materials
Material Name
Tipo
Company
Catalogue Number
Comment
10.5 – 11.5 dpc pregnant C57BL6J female mouse crossed with the same background male mouse.
Mouse Fibroblast MEF-CF1 ATCC
SCRC-1040
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS)
Invitrogen
14190/086
Collagenase /Dispase Solution
Roche
269638
Gelatin
Sigma
G1890
Mitomycin C
Sigma
M4287
Trypsin EDTA
Invitrogen
25200-072
MEF Medium: Dulbecco Medium Eagle Modified (D-MEM) GLUTAMAX High glucose
with β-mercaptoethanol Sigma Catalogue Number: M7522
1X non essential amino acid solution
Invitrogen
11140/050
1% antibiotic-antimycotic
Invitrogen
15420/096
supplemented with grow factor as 2500 U of Leukemia inhibitory factor (mLIF-ESGRO) Millipore Catalogue Number: ESG1106
40 ng/ml of Recombinant Murine Stem Cell Factor (SCF) ReproTech
250-03
20 ng/ml of Basic Fibroblast Growth factor (bFGF)
Invitrogen
13256-029
Corning center well culture dish 60mm
Fisher
07-200-79
1.5 ml eppendorf tube, and 15 ml falcon tubes
Forceps No. 14 and 15, scalpel 35 mm, dissection scissors, surgical fields, antimicrobial soap, saline solution 0.9 %, gauze, ice foam container, razor blade, scalpel 35 mm, fine forceps No. 4 and 5, fine teasing needle with handle, filter paper sheets, and pulled glass pipettes.
Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet.
Moreno-Ortiz, H., Esteban-Perez, C., Badran, W., Kent-First, M. Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells. J. Vis. Exp. (32), e1635, doi:10.3791/1635 (2009).