Isolatie en Afleiding van muis embryonale cellen Germinal
Summary
Het vermogen van embryonale kiemcellen om in primordiale kiemcellen differentiëren tijdens de vroege ontwikkelingsstadia is een perfect model om onze hypothese te pakken over kanker en onvruchtbaarheid. Dit protocol laat zien hoe primordiale kiemcellen van de ontwikkeling van gonaden isoleren in 10.5-11.5 dagen na coitum muizenembryo's.
Abstract
Het vermogen van embryonale kiemcellen (EG) om te differentiëren in primordiale kiemcellen (PGC) en later in de gameten tijdens de vroege ontwikkelingsstadia is een perfect model om onze hypothese te pakken over kanker en onvruchtbaarheid. Dit protocol laat zien hoe primordiale kiemcellen van de ontwikkeling van gonaden isoleren in 10.5-11.5 dagen na coitum (DPC) muizenembryo's. Het ontwikkelen van gonadale richels van muis embryo's (C57BL6J) zijn gedissocieerd door een mechanische storing met collagenase, en afgewerkt in een muis embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) die eerder mitotisch was met mitomycine C geïnactiveerd in de aanwezigheid van knock-out media en aangevuld met leukemie Inhibitor Factor (LIF), basic fibroblast groeifactor (bFGF), en Stem Cell Factor (SCF). Met behulp van deze geoptimaliseerde methoden voor PCG identificatie, isolatie, en de vestiging van de kweekomstandigheden vergunningen op lange termijn culturen van EG-cellen voor meer dan 40 dagen. De embryonale germinale cellijnen toonde embryonale fenotype en expressie van de gemeenschappelijke gebruikte markers van de pluripotente staat. Isolatie en afleiding van germinale cellen in de cultuur een middel om hun ontwikkeling te begrijpen in vitro en bieden de mogelijkheid om cumulatieve schade monitor genetische en epigenetische niveaus na blootstelling aan oxidatieve stress.
Protocol
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag de onschatbare hulp van luidt: dr. Neal Eerste en Kourtney Wilkinson voor het manuscript te bewerken; dr. Lucy Senter, dr. Brigit Willeford en Mike Basett voor hulp bij training en verzorging van dieren op de MSU ALAC geaccrediteerde muis faciliteit; Dr Dwayne Wise voor zijn hulp bij microscopie en beeld vast te leggen, Cesar Monroy, Hannah Swoope en Bobbie Huddleston voor hun hulp met een video productie MSU. Dit onderzoek werd gefinancierd door het Bureau van Institutioneel Onderzoek en het Departement van Biologische Wetenschappen aan de Mississippi State University.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 10.5 – 11.5 dpc pregnant C57BL6J female mouse crossed with the same background male mouse. | ||||
| Mouse Fibroblast MEF-CF1 ATCC | SCRC-1040 | |||
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Invitrogen | 14190/086 | ||
| Collagenase /Dispase Solution | Roche | 269638 | ||
| Gelatin | Sigma | G1890 | ||
| Mitomycin C | Sigma | M4287 | ||
| Trypsin EDTA | Invitrogen | 25200-072 | ||
| MEF Medium: Dulbecco Medium Eagle Modified (D-MEM) GLUTAMAX High glucose | Invitrogen | 10566024 | ||
| 10% Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16000/044 | ||
| 1% of antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15420/096 | ||
| Knockout Media: 80% knockout D-MEM | Invitrogen | 10829/018 | ||
| 20% Knockout serum Invitrogen Cat. No. 1028/028, 200mM L-glutamine Invitrogen | 25130/081 | with β-mercaptoethanol Sigma Catalogue Number: M7522 | ||
| 1X non essential amino acid solution | Invitrogen | 11140/050 | ||
| 1% antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15420/096 | supplemented with grow factor as 2500 U of Leukemia inhibitory factor (mLIF-ESGRO) Millipore Catalogue Number: ESG1106 | |
| 40 ng/ml of Recombinant Murine Stem Cell Factor (SCF) ReproTech | 250-03 | |||
| 20 ng/ml of Basic Fibroblast Growth factor (bFGF) | Invitrogen | 13256-029 | ||
| Corning center well culture dish 60mm | Fisher | 07-200-79 | 1.5 ml eppendorf tube, and 15 ml falcon tubes |
Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet.
Referências
- DeFelici, M. . Cell Biology: A laboratory Handbook. 1, 73-85 (1998).
- Donovan, P. J., De Miguel, M. P. Turning Germ Cells into Stem Cells. Current Opinion in Genetics and Development. 13, 463-471 (2003).
- Labosky, P. A., Hogan, B. L. M., Sharp, P. T., Mason, I. Part 12: Mouse Primordial Germ Cells: isolation and in vitro culture. Molecular embryology: methods and protocols. 97, (1999).
- Mc Laren, A., Southee, D. Entry of Mouse Embryonic Germ Cells into Meiosis. Biologia do Desenvolvimento. 187, 107-113 (1997).
- Yoshimizu, T., Obinata, M., Matsui, Y. Stage-specific tissue and cell interactions play key roles in mouse germ cell specification. Development. 128, 481-490 (2001).
- Zhang, J., Hhvorostov, I., Teitell, M. From MEFs to Matrigel I: Passaging hESCs in the Presence of MEFs. J Vis Exp. , (2008).
