היכולת של תאים עובריים נבטי להתמיין לתאי נבטי קדמוני בשלבי הפיתוח המוקדמים הוא מודל מושלם לכתובת ההשערה שלנו לגבי סרטן פוריות. פרוטוקול זה מראה כיצד לבודד תאים נבטי קדמוני של בלוטות המין המתפתחות 10.5-11.5 ימים coitum עוברים לפרסם העכבר.
Abstract
היכולת של תאים עובריים נבטי (למשל) כדי להתמיין לתאי נבטי קדמוני (PGCs) ומאוחר יותר לתוך הגמטות במהלך שלבי ההתפתחות המוקדמים הוא מודל מושלם לכתובת ההשערה שלנו לגבי סרטן פוריות. פרוטוקול זה מראה כיצד לבודד תאים נבטי קדמוני של בלוטות המין המתפתחות 10.5-11.5 בימים שלאחר coitum (DPC) עוברי עכברים. פיתוח רכסים האשכים מעוברים העכבר (C57BL6J) היו מנותקים על ידי הפרעה מכנית עם collagenase, אז מצופה שכבה העובר עכבר מזין פיברובלסטים (MEF-CF1) כי היה בעבר מומת mitotically בנוכחות התקשורת בנוקאאוט עם mitomycin C שיושלם עם מעכבי לוקמיה פקטור (LIF), פיברובלסטים בסיסי גורם הגדילה (bFGF), וכן גורם לתאי גזע (SCF). שימוש בשיטות אלה אופטימיזציה עבור זיהוי ובידוד PCG, והקמת התנאים תרבות היתרי תרבויות ארוך טווח של תאים EG במשך יותר מ 40 ימים. הקווים עובריים נבטי הראו פנוטיפ הביטוי עובריים של סמנים בשימוש משותף של המדינה pluripotent. בידוד הגזירה של תאים נבטי בתרבות לספק כלי להבין את התפתחותם במבחנה מציעים את ההזדמנות כדי לפקח על נזק מצטבר ברמות גנטיים epigenetic לאחר חשיפה סטרס חמצוני.
Protocol
חלק 1: laparotomy עכבר בהריון שימוש נקע בצוואר הרחם, להרדים עכבר בהריון C57BL6J נקבה ב 10.5-11.5 DPC. נקו את הבטן עם סבון מיקרוביאלית, ולאחר מכן, לגלח אותו. לאחר גילוח, לשטוף את הבט…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להכיר לעזור יסולא בפז של: ד"ר ניל הראשונה Kourtney וילקינסון עבור עריכת כתב היד, ד"ר לוסי Senter, ד"ר Brigit Willeford ומייק Basett לסיוע בטיפול הדרכה חיה במתקן ALAC MSU העכבר מוכר; ד"ר דוויין וייז עבור עזרתו עם מיקרוסקופיה לכידת תמונה: סזאר מונרוי, חנה Swoope, ובובי Huddleston על עזרתם עם ייצור וידאו MSU. מחקר זה מומן על ידי משרד המחקר המוסדיים ואת המחלקה למדעי הביולוגיה על מיסיסיפי סטייט.
Materials
Material Name
Tipo
Company
Catalogue Number
Comment
10.5 – 11.5 dpc pregnant C57BL6J female mouse crossed with the same background male mouse.
Mouse Fibroblast MEF-CF1 ATCC
SCRC-1040
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS)
Invitrogen
14190/086
Collagenase /Dispase Solution
Roche
269638
Gelatin
Sigma
G1890
Mitomycin C
Sigma
M4287
Trypsin EDTA
Invitrogen
25200-072
MEF Medium: Dulbecco Medium Eagle Modified (D-MEM) GLUTAMAX High glucose
with β-mercaptoethanol Sigma Catalogue Number: M7522
1X non essential amino acid solution
Invitrogen
11140/050
1% antibiotic-antimycotic
Invitrogen
15420/096
supplemented with grow factor as 2500 U of Leukemia inhibitory factor (mLIF-ESGRO) Millipore Catalogue Number: ESG1106
40 ng/ml of Recombinant Murine Stem Cell Factor (SCF) ReproTech
250-03
20 ng/ml of Basic Fibroblast Growth factor (bFGF)
Invitrogen
13256-029
Corning center well culture dish 60mm
Fisher
07-200-79
1.5 ml eppendorf tube, and 15 ml falcon tubes
Forceps No. 14 and 15, scalpel 35 mm, dissection scissors, surgical fields, antimicrobial soap, saline solution 0.9 %, gauze, ice foam container, razor blade, scalpel 35 mm, fine forceps No. 4 and 5, fine teasing needle with handle, filter paper sheets, and pulled glass pipettes.
Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet.
Moreno-Ortiz, H., Esteban-Perez, C., Badran, W., Kent-First, M. Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells. J. Vis. Exp. (32), e1635, doi:10.3791/1635 (2009).