マウスES胚細胞の単離と導出
Summary
開発の初期段階で始原生殖細胞に分化する胚性生殖細胞の能力は、がんと不妊についての我々の仮説に対応するために最適なモデルです。このプロトコルは、10.5から11.5日後に交尾のマウス胚での開発生殖腺から始原生殖細胞を単離する方法を示しています。
Abstract
初期の発達段階の間に後で配偶子への始原生殖細胞（始原生殖細胞）に分化し、胚性生殖細胞の能力（EG）は、がんと不妊についての我々の仮説に対応するために最適なモデルです。このプロトコルは、10.5から11.5日後に交尾（DPC）のマウス胚での開発生殖腺から始原生殖細胞を単離する方法を示しています。マウス胚から生殖腺隆起（C57BL6J）を開発してから以前に分裂ノックアウト媒体の存在下でマイトマイシンCで不活化し、白血病阻害剤を添加したマウス胚線維芽細胞のフィーダー層（MEF – CF1）に播種、コラゲナーゼと機械的な破砕により解離させた因子（LIF）、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）、および幹細胞因子（SCF）。培養条件のPCG識別、分離、および確立のためにこれらの最適化されたメソッドを使用すると、40日以上用EG細胞の長期培養を可能にします。胚性生殖細胞系は、多能性の状態の一般的な使用されるマーカーの胚の表現型と発現を示した。単離および培養中の胚細胞の派生は、in vitroでその開発を理解し、酸化ストレスへの曝露後の遺伝的およびエピジェネティックなレベルでの累積損傷を監視する機会を提供するツールを提供しています。
Protocol
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
;博士ルーシーセンター、博士ブリジットウィルフォードとMSU ALAC認定マウスの施設での研修や動物のケアと支援のためのマイクBasett、博士ドウェインワイズ博士ニールまず、原稿編集のためKourtneyウィルキンソン：著者はの非常に貴重な助けに感謝セザールモンロイ、ハンナスウォープ、およびMSUのビデオ制作とその支援のためのボビーハドルストン、顕微鏡と画像キャプチャと彼の支援のための。この研究は、インスティテューショナルリサーチとミシシッピ州立大学で生物科学科のオフィスによって資金を供給された。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 10.5 – 11.5 dpc pregnant C57BL6J female mouse crossed with the same background male mouse. | ||||
| Mouse Fibroblast MEF-CF1 ATCC | SCRC-1040 | |||
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Invitrogen | 14190/086 | ||
| Collagenase /Dispase Solution | Roche | 269638 | ||
| Gelatin | Sigma | G1890 | ||
| Mitomycin C | Sigma | M4287 | ||
| Trypsin EDTA | Invitrogen | 25200-072 | ||
| MEF Medium: Dulbecco Medium Eagle Modified (D-MEM) GLUTAMAX High glucose | Invitrogen | 10566024 | ||
| 10% Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16000/044 | ||
| 1% of antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15420/096 | ||
| Knockout Media: 80% knockout D-MEM | Invitrogen | 10829/018 | ||
| 20% Knockout serum Invitrogen Cat. No. 1028/028, 200mM L-glutamine Invitrogen | 25130/081 | with β-mercaptoethanol Sigma Catalogue Number: M7522 | ||
| 1X non essential amino acid solution | Invitrogen | 11140/050 | ||
| 1% antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15420/096 | supplemented with grow factor as 2500 U of Leukemia inhibitory factor (mLIF-ESGRO) Millipore Catalogue Number: ESG1106 | |
| 40 ng/ml of Recombinant Murine Stem Cell Factor (SCF) ReproTech | 250-03 | |||
| 20 ng/ml of Basic Fibroblast Growth factor (bFGF) | Invitrogen | 13256-029 | ||
| Corning center well culture dish 60mm | Fisher | 07-200-79 | 1.5 ml eppendorf tube, and 15 ml falcon tubes |
Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet.
Referências
- DeFelici, M. . Cell Biology: A laboratory Handbook. 1, 73-85 (1998).
- Donovan, P. J., De Miguel, M. P. Turning Germ Cells into Stem Cells. Current Opinion in Genetics and Development. 13, 463-471 (2003).
- Labosky, P. A., Hogan, B. L. M., Sharp, P. T., Mason, I. Part 12: Mouse Primordial Germ Cells: isolation and in vitro culture. Molecular embryology: methods and protocols. 97, (1999).
- Mc Laren, A., Southee, D. Entry of Mouse Embryonic Germ Cells into Meiosis. Biologia do Desenvolvimento. 187, 107-113 (1997).
- Yoshimizu, T., Obinata, M., Matsui, Y. Stage-specific tissue and cell interactions play key roles in mouse germ cell specification. Development. 128, 481-490 (2001).
- Zhang, J., Hhvorostov, I., Teitell, M. From MEFs to Matrigel I: Passaging hESCs in the Presence of MEFs. J Vis Exp. , (2008).
