Isolering och Härledning av Mouse Embryonala Germinal celler
Summary
Förmågan hos embryonala embryon cellerna differentieras till primordial embryon celler under tidiga utvecklingsskeden är ett perfekt sätt att hantera vår hypotes om cancer och infertilitet. Detta protokoll visar hur man kan isolera ursprungliga embryon celler från att utvecklas gonaderna 10,5-11,5 dagar mus inlägg coitum embryon.
Abstract
Förmågan hos embryonala embryon celler (t.ex.) att differentieras till ursprungliga embryon celler (PGCs) och senare i könsceller under tidiga utvecklingsstadier är en perfekt modell för att ta itu med vår hypotes om cancer och infertilitet. Detta protokoll visar hur man kan isolera ursprungliga embryon celler från att utvecklas gonaderna 10,5-11,5 dagar efter coitum (DPC) musembryon. Utveckla gonad åsar från mus embryon (C57BL6J) har tagit avstånd genom mekanisk störning med kollagenas, sedan beläggas med en mus embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) som tidigare var mitotically inaktiveras med mitomycin C i närvaro av knockout medier och kompletteras med leukemi Inhibitor Factor (LIF), grundläggande Fibroblast Growth Factor (bFGF) och Stem Cell Factor (SCF). Med hjälp av dessa optimerade metoder för PCG identifiering, isolering, och etablering av odlingsbetingelser tillåter långsiktiga kulturer av EG celler för mer än 40 dagar. Den embryonala embryon cellinjer visade embryonala fenotyp och uttryck för gemensamma används markörer av pluripotenta staten. Isolering och härledning av embryon celler i kultur som ett verktyg för att förstå deras utveckling in vitro och ger möjlighet att följa kumulativa skador på genetisk och epigenetisk nivå efter exponering för oxidativ stress.
Protocol
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka för den ovärderliga hjälp av Dr Neal Först och Kourtney Wilkinson för manuskriptet redigering, Dr Lucy Senter, Dr Brigit Willeford och Mike Basett för hjälp med utbildning och djuromsorg vid MSU ALAC ackrediterade musen anläggning, Dr Dwayne Wise för hans hjälp med mikroskopi och ta bilder, Cesar Monroy, Hannah Swoope och Bobbie Huddleston för deras hjälp med videoproduktion vid MSU. Denna forskning har finansierats av byrån för institutionell forskning och Institutionen för biologiska vetenskaper vid Mississippi State University.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 10.5 – 11.5 dpc pregnant C57BL6J female mouse crossed with the same background male mouse. | ||||
| Mouse Fibroblast MEF-CF1 ATCC | SCRC-1040 | |||
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Invitrogen | 14190/086 | ||
| Collagenase /Dispase Solution | Roche | 269638 | ||
| Gelatin | Sigma | G1890 | ||
| Mitomycin C | Sigma | M4287 | ||
| Trypsin EDTA | Invitrogen | 25200-072 | ||
| MEF Medium: Dulbecco Medium Eagle Modified (D-MEM) GLUTAMAX High glucose | Invitrogen | 10566024 | ||
| 10% Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16000/044 | ||
| 1% of antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15420/096 | ||
| Knockout Media: 80% knockout D-MEM | Invitrogen | 10829/018 | ||
| 20% Knockout serum Invitrogen Cat. No. 1028/028, 200mM L-glutamine Invitrogen | 25130/081 | with β-mercaptoethanol Sigma Catalogue Number: M7522 | ||
| 1X non essential amino acid solution | Invitrogen | 11140/050 | ||
| 1% antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15420/096 | supplemented with grow factor as 2500 U of Leukemia inhibitory factor (mLIF-ESGRO) Millipore Catalogue Number: ESG1106 | |
| 40 ng/ml of Recombinant Murine Stem Cell Factor (SCF) ReproTech | 250-03 | |||
| 20 ng/ml of Basic Fibroblast Growth factor (bFGF) | Invitrogen | 13256-029 | ||
| Corning center well culture dish 60mm | Fisher | 07-200-79 | 1.5 ml eppendorf tube, and 15 ml falcon tubes |
Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet.
Referências
- DeFelici, M. . Cell Biology: A laboratory Handbook. 1, 73-85 (1998).
- Donovan, P. J., De Miguel, M. P. Turning Germ Cells into Stem Cells. Current Opinion in Genetics and Development. 13, 463-471 (2003).
- Labosky, P. A., Hogan, B. L. M., Sharp, P. T., Mason, I. Part 12: Mouse Primordial Germ Cells: isolation and in vitro culture. Molecular embryology: methods and protocols. 97, (1999).
- Mc Laren, A., Southee, D. Entry of Mouse Embryonic Germ Cells into Meiosis. Biologia do Desenvolvimento. 187, 107-113 (1997).
- Yoshimizu, T., Obinata, M., Matsui, Y. Stage-specific tissue and cell interactions play key roles in mouse germ cell specification. Development. 128, 481-490 (2001).
- Zhang, J., Hhvorostov, I., Teitell, M. From MEFs to Matrigel I: Passaging hESCs in the Presence of MEFs. J Vis Exp. , (2008).
